反式环氧琥珀酸水解酶的筛选及其异源表达

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meso-酒石酸(meso-tartaric acid,内消旋酒石酸)在盐业、膜电解等方面具有重要的用途。meso-酒石酸主要是由反式环氧琥珀酸水解酶(TESH)水解底物反式环氧琥珀酸而得。迄今已见的关于meso-酒石酸生物转化技术的报道仅限于野生菌筛选和发酵工艺研究,其TESH酶活低且酶稳定性差。因此,获得高活力和高稳定性的TESH酶及其高效活性表达菌株对于工业化应用具有重要的意义。  本文从土壤中筛选到一株可产TESH的野生菌,经形态学观察、生理生化试验以及16S rDNA序列比对鉴定为韩国假单胞菌,命名为Pseudomonas koreensisBK-9。利用硫酸铵沉淀、阴离子柱层析和疏水柱层析技术,从Pseudomonaskoreensis BK-9中分离得到纯的TESH酶。经蛋白质质谱检测,其分子量为32.25kDa。该TESH在温度小于40℃、pH3.5-11时比较稳定。该TESH不是金属离子依赖型酶,对反式环氧琥珀酸的动力学参数Km和max分别为8.22±0.2mM和2.5±0.1mM/min。  在测得该TESH酶末端序列的基础上,设计引物,克隆得到TESH编码基因,并在大肠杆菌中实现高效活性表达。该基因工程菌在5L发酵罐中最高酶活可达到35542 U/g,是一株适合进行工业化生产meso-酒石酸的菌株。
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