【摘 要】
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多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是一类被广泛研究可产生抗菌蛋白等多种生物活性物质的生防细菌,在工业、医药、农业、食品等多领域具有广阔的开发前景和应用价值。本课题组筛选得到的一株高产抗菌蛋白的多粘类芽孢杆菌CP7,已有的研究表明其对真菌和细菌有良好的抑制灭杀作用,抗菌谱广。为了更好的开发利用CP7菌,本论文测定了CP7菌株发酵液对肺炎克雷伯菌等八种菌的抗菌活性,并对CP
【基金项目】
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国家现代农业产业技术体系建设专项（CARS-22）；
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多粘类芽孢杆菌（Paenibacillus polymyxa）是一类被广泛研究可产生抗菌蛋白等多种生物活性物质的生防细菌,在工业、医药、农业、食品等多领域具有广阔的开发前景和应用价值。本课题组筛选得到的一株高产抗菌蛋白的多粘类芽孢杆菌CP7,已有的研究表明其对真菌和细菌有良好的抑制灭杀作用,抗菌谱广。为了更好的开发利用CP7菌,本论文测定了CP7菌株发酵液对肺炎克雷伯菌等八种菌的抗菌活性,并对CP7固体发酵条件进行筛选优化,主要结果如下:1、运用生长速率、滤纸片法等检测方法,测定了CP7发酵液对肺炎克雷伯菌、鼠伤寒沙门氏菌、痤疮丙酸杆菌、表皮葡萄球菌、石膏样孢子菌、红色毛藓菌等8种菌的抗菌活性。（1）运用滤纸片法测定CP7发酵液对痤疮丙酸杆菌ATCC 6919、表皮葡萄球菌ATCC 12228、肺炎克雷伯菌和鼠伤寒沙门氏菌等4种细菌的抗菌效果,结果表明CP7发酵液对表皮葡萄球菌ATCC 12228有较强的抑菌效果,其抑菌圈直径为18.41mm;对痤疮丙酸杆菌ATCC 6919、肺炎克雷伯菌和鼠伤寒沙门氏菌有一定的抑菌效果,抑菌圈直径分别为7.98mm、8.15mm、8.41mm。（2）采用生长速率测定法检测CP7发酵液对石膏样孢子菌ATCC 14683和红色毛藓菌ATCC MYA-4438两种真菌的抗菌效果,结果显示:CP7发酵液对石膏样孢子菌、红色毛藓菌的菌丝生长均有较强的抑制作用,抑制率分别为90.38%和72%。（3）采用琼脂孔扩散法测定了金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的抑菌效价,结果表明CP7发酵液对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌均有较强的抑菌效果,其抑菌圈直径分别可达15.81mm、13.99mm。2、优化确立了CP7固体发酵的培养基配方和发酵条件,以CP7生长菌落数和CP7发酵物提取液对金黄色葡萄球菌的抑菌圈大小两个指标来评价固体发酵的效果。（1）以黄豆粉为氮源,稻壳、麸皮和玉米粉作为碳源,碳源（g）和氮源（g）按4﹕1的比例添加,31℃发酵48h后,麸皮和玉米粉的活菌数分别为2.0×10~8cfu/g和1.55×10~8cfu/g,抑菌圈大小分别为14.60mm和12.29mm;稻皮的活菌数为0,无抑菌效果;因此筛选麸皮为最佳碳源;（2）以麸皮为碳源,酵母粉、黄豆粉、豆粕作为氮源,碳源（g）和氮源（g）按4﹕1的比例添加,结果表明酵母粉的活菌数为0,无抑菌效果;黄豆粉和豆粕的活菌数分别为2.53×10~8cfu/g和3.67×10~8cfu/g,抑菌圈大小分别为10.39mm和12.14mm,因此筛选豆粕为最佳碳源;（3）设计麸皮豆粕质量比分别为1∶2、1∶1、2∶1、4∶1、6∶1、8∶1,结果表明当麸皮豆粕质量添加比为4∶1时,发酵效果最好,此时活菌数为2.37×10~8cfu/g,抑菌圈直径为12.27mm;（4）固定以上发酵条件,添加质量分数为2%、0.2%、0.02%、0.002%（w/w）4个不同浓度的K2HPO4·2H2O,结果表明添加0.2%（w/w）K2HPO4·2H2O发酵效果最佳,活菌数为3.33×10~9cfu/g,抑菌圈直径为19.05mm;在此基础上筛选Mg SO4最佳添加浓度,分别设1%、0.1%、0.01%、0.001%（w/w）4个浓度,发酵结果表明添加0.01%（w/w）硫酸镁效果最好,活菌数为6.33×10~9cfu/g,抑菌圈直径为17.01mm;此外添加Mn SO4对发酵无影响。（5）固定其他发酵条件,筛选最佳料水比,结果表明当料水比为3g∶4m L时发酵效果最佳,活菌数为5.50×10~9cfu/g,抑菌圈直径为17.01mm;（6）在培养基中分别接种CP7种子液1～4m L（约10~6cfu/m L）发酵培养,结果表明接菌量为3m L时发酵效果最佳,活菌数为2.43×10~8cfu/g,抑菌圈直径为11.72mm。经优化筛选,确立了CP7菌固体发酵的最佳配方及发酵条件为:麸皮12g,豆粕3g,K2HPO4·2H2O 30mg、Mg SO41.5mg、水20m L、接种量3m L（约10~6cfu/m L）,固体发酵温度31℃,发酵时间48h。3、对CP7固体发酵产物进行了评价。发酵产物呈黄色,具有豆粕特有的香气,略带酸味。发酵产物提取液具有良好的抑菌作用,对金黄葡萄球菌的抑菌圈直径为18.86mm。较发酵前,有效磷含量提高了48.44%;蛋白溶解度提高了11.24%,酸溶蛋白含量提高了35.85%。说明经发酵后的麸皮豆粕富含抗菌活性物质,而且营养物质更容易被吸收利用。
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