山羊AP1M1基因的克隆、多克隆抗体制备及表达模式分析

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AP1M1基因(adaptorrelatedproteincomplex1mu1subunit)编码衔接蛋白复合体AP-1A的μ1A亚基,属于衔接蛋白家族成员,在细胞内货物蛋白分选信号的识别机制上发挥着重要作用,参与了胞吐作用中分泌泡的形成、细胞膜上受体的循环等机体多种重要生理功能。睾丸作为机体重要的生殖器官,不仅是精子生成的场所,也是重要的内分泌器官。AP1M1影响小鼠和人的睾丸发育,可能参与雄性动物的繁殖。目前,有关AP1M1影响睾丸发育机制的研究报道还比较少,有待进一步的证据支持。  本研究以大足黑山羊为研究动物,首次成功克隆了山羊AP1M1基因的编码序列,并在此基础上,制作了山羊AP1M1分子的多克隆抗体,之后检测了AP1M1的在成年大足黑山羊各组织及睾丸组织不同发育时期的表达量。相关研究结果如下:  1、克隆了山羊AP1M1基因  鉴于目前尚无山羊AP1M1基因序列报道,通过设计两对特异性引物,经序列拼接,首次成功克隆得到了山羊AP1M1基因序列(GenBank登录号:MH155258),其cDNA序列全长1661bp,开放阅读框为1272bp,编码423个氨基酸,预测分子量48.59KD;序列分析表明该基因在进化上高度保守;含有5个蛋白质-蛋白质结合位点,不含蛋白质-核酸结合位点;有19个磷酸化位点,这些磷酸化位点可能对于AP1M1识别基于酪氨酸的分选信号“YXXΦ”起着重要作用;不含跨膜区,信号肽结构;含有一个网格蛋白衔接蛋白蛋白复合体小链(Clathrinadaptorcomplexsmallchain,Clat-adaptor)结构域和一个Adap-comp结构域。  2、制备了山羊AP1M1分子的多克隆抗体  为了对AP1M1的功能进行深入研究,构建了pET30a(+)-his-AP1M1原核表达载体。对诱导表达条件进行筛选,表明在0.2mMIPTG,16℃,诱导20h条件下诱导效果较好;重组蛋白主要以包涵体形式存在;对包涵体进行处理,结果表明包涵体经4M尿素洗涤30min,8M尿素溶解,300mM咪唑镍柱洗脱,可获得SDS-PAGE条带单一的目标蛋白;动物免疫后获得的抗血清经Westernblotting和间接Elisa检测,表明成功获得了兔抗山羊的AP1M1多克隆抗体。  3、分析了AP1M1在成年山羊不同组织以及睾丸发育各时期中的表达模式  采用Q-PCR及Westernblotting技术对AP1M1在山羊组织中的表达模式进行分析,结果表明AP1M1在各组织的转录水平和蛋白水平表达模式一致,其中在睾丸中表达量较高,且随着睾丸的发育,表达量有逐渐升高的趋势,体成熟时期达到最高,预示AP1M1与睾丸发育有关,可能参与了雄性动物的繁殖。  本实验为进一步研究AP1M1分子的功能提供了理论基础,也为研究AP1M1在睾丸发育过程中的功能奠定了基础。
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