【摘 要】
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研究目的:室性心律失常是心肌梗死后心源性猝死最主要的危险因素,其防治也是世界性公共卫生的重点和难题。尽管已有大量研究探究出室性心律失常发生的分子机制如离子通道的异常、心肌细胞间缝隙连接蛋白的异常等,然而对于心律失常仍缺乏有效的治疗手段,大部分抗心律失常药物在治疗的同时又存在致心律失常的风险。因此,更进一步的了解心律失常发生机制,寻找更有效的作用靶点和干预手段具有重要的意义。Caveolin-3（C
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研究目的:室性心律失常是心肌梗死后心源性猝死最主要的危险因素,其防治也是世界性公共卫生的重点和难题。尽管已有大量研究探究出室性心律失常发生的分子机制如离子通道的异常、心肌细胞间缝隙连接蛋白的异常等,然而对于心律失常仍缺乏有效的治疗手段,大部分抗心律失常药物在治疗的同时又存在致心律失常的风险。因此,更进一步的了解心律失常发生机制,寻找更有效的作用靶点和干预手段具有重要的意义。Caveolin-3（Cav3）是心肌细胞小凹结构的主要组成蛋白,可介导细胞内外多种调节活动。已有大量研究表明,Cav3在心血管系统中发挥着重要的调节作用,过表达Cav3对多种心血管系统疾病例如肥厚型心肌病,心肌缺血再灌注损伤,糖尿病心肌病等具有保护作用,然而Cav3对于心肌梗死后室性心律失常的作用仍不清楚。在本研究中,我们探究心脏特异性过表达Cav3是否在预防心肌梗死后室性心律失常和心源性猝死的发生中发挥重要的保护作用。实验方法与结果:1.在动物实验中,检测心脏特异性过表达Cav3对心肌梗死后室性心律失常的作用。将小鼠随机分为四个组:r AAV-c TNT-RFP+假手术组,r AAV-c TNT-RFP+心肌梗死组,r AAV-c TNT-Cav3+假手术组,r AAV-c TNT-Cav3+心肌梗死组,通过尾静脉注射的方法将重组r AAV-c TNT-RFP和r AAV-c TNT-Cav3病毒注入小鼠体内,分别获得空白对照小鼠和心脏特异性过表达Cav3小鼠。注射病毒4周后,心肌梗死组小鼠行冠脉左前降支结扎术,术后24小时分别检测各组小鼠心肌梗死后室性心律失常的发生率。结果发现心脏特异性过表达Cav3可显著减少小鼠心肌梗死后室性心律失常和心源性猝死事件的发生。2.进一步通过体外实验探究Cav3在心律失常发生中的作用机制,通过转染过表达质粒使培养的心肌细胞过表达Cav3,转染24小时后缺氧处理模拟在体心肌缺血环境,采用实时定量PCR技术发现过表达Cav3可以调控心律失常相关分子Plakophilin-2（Pkp2）的表达,并在动物组织中通过蛋白质免疫印迹法验证了这一结论。进一步又通过免疫荧光技术和免疫共沉淀技术发现Cav3和Pkp2可能直接产生相互作用。3.采用Langendorff灌流系统提取各实验组成年小鼠心肌细胞,通过钙成像技术评估各组小鼠心室肌细胞心律失常发生的易感性。结果发现心肌梗死可使心肌细胞产生自发性钙释放的比例增加,而心脏特异性过表达Cav3可减少产生自发性钙释放心肌细胞的比例。为进一步探究Cav3产生该影响的机制,我们通过蛋白质免疫印迹法发现心肌梗死后小鼠心脏组织二型雷诺定受体丝氨酸2814位点（Ry R2Ser2814）和2808位点（Ry R2Ser2808）的磷酸化明显升高,而过表达Cav3可抑制Ry R2Ser2814的过磷酸化。4.为了探究Pkp2在Cav3对于心肌细胞钙活动调节中的作用,在体外通过转染过表达质粒和si RNA分别在心肌细胞上过表达Cav3和敲低Pkp2,转染24小时后缺氧处理,通过蛋白质免疫印迹法检测心肌细胞Ry R2Ser2814磷酸化水平变化。结果发现敲低Pkp2后,Cav3对于Ry R2Ser2814位点过磷酸化的抑制作用减弱了。实验结论:综上研究结果,我们发现心脏特异性过表达Cav3可通过Pkp2抑制心肌梗死后心肌细胞Ry R2Ser2814的过磷酸化,从而减少心肌梗死后心肌细胞产生自发性钙释放,进而降低心肌梗死后室性心律失常和心源性猝死事件的发生率。我们的研究成果揭示了Cav3在预防心肌梗死后室性心律失常和心源性猝死事件发生中的新作用,为该种类型心律失常的防治提供了新的思路。
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