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目的:克隆并鉴定鼠HMGB1基因;原核表达HMGB1蛋白,制备多克隆抗体;检测类风湿性关节炎患者外周血中高迁移率族蛋白1(highmobility group box chromosomal protein 1,HMGB1)及Th17主要转录因子及相关细胞因子的表达水平,分析HMGB1、Th17细胞相关因子及某些临床检验指标之间的相关性;通过体外HMGB1对Th17细胞的诱导作用,初步探讨HMGB1在类风湿性关节炎中可能的作用机制。方法:1)采用RT-PCR方法从小鼠脾脏细胞获得HMGB1基因全长,克隆至pMD18-T载体,转化E.coli DH5α宿主菌,挑取菌落进行进行单、双酶切鉴定及序列分析。2)将HMGB1基因克隆到pET28原核表达载体,在大肠埃希菌Rossta中表达,获得带有His标签的30KD左右的HMGB1融合蛋白;利用Bio-Rad公司的IMAC柱纯化HMGB1蛋白;用抗-His抗体对HMGB1融合蛋白进行Westernblot鉴定。以HMGB1蛋白作为抗原免疫家兔,收集含抗HMGB1多克隆抗体的兔血清,并用酶联免疫吸附(ELISA)法鉴定抗体的效价。3)收集江苏大学附属医院-镇江市第一人民医院门诊80例类风湿性关节炎(rheumatoid arthritis,RA)患者外周血标本,其中静止期32例、活动期48例,健康志愿者50例。4) HMGB1与小鼠CD4~+T细胞的共培养。5)采用实时荧光定量PCR(QRT-PCR)及ELISA检测标本PBMC中HMGB1及Th17相关因子的表达水平。6)采用流式分析(FACS)法检测标本中CD3~+CD8~-IL-17~+细胞的比率。结果:1.鼠HMGB1基因克隆,表达及多克隆抗体制备结果1)成功克隆了包括648bp编码区的鼠HMGB1基因全长,与Genebank中发表的序列完全一致。2)在大肠埃希菌经诱导和纯化获得HMGB1融合蛋白,大小约为30KD。3)成功制备了针对鼠HMGB1蛋白的多克隆抗体,经ELISA和Western blot鉴定,具有良好的反应性,也表明融合蛋白具有良好的免疫原性。2.RA病人相关检测分析结果1) QRT-PCR分析结果显示:与健康对照组比较,RA患者组PBMC中HMGB1及Th17细胞的主要转录因子RORγt和相关的细胞因子IL-17 mRNA表达水平显著升高(P＜0.05);活动期RA患者高于静止期患者表达水平(P＜0.05)。相关性分析表明,RA患者HMGB1与Th17细胞相关因子表达水平有明显相关性。2) ELISA检测结果显示:RA患者血浆IL-17、IL-23呈高表达,与健康对照组差异明显(P＜0.05)。3)流式分析结果显示:RA患者CD3~+CD8~-IL17~+T细胞比率部分明显高于健康对照组。3.HMGB1体外诱导Th17细胞的试验结果HMGB1刺激小鼠CD4~+T细胞结果显示:HMGB1对Th17的诱导呈现时间剂量效应,在浓度为100ng/ml作用12h对Th17细胞有最佳的诱导效果。结论:获得了鼠HMGB1基因克隆并制备和纯化了鼠HMGB1蛋白及多克隆抗体;类风湿性关节炎患者PBMC中HMGB1和Th17细胞的表达水平高于健康者,且RA患者HMGB1的表达与Th17细胞相关因子及临床检测指标的表达均呈现正相关,说明HMGB1与RA的发生相关;体外HMGB1对Th17细胞有诱导分化的作用,表明作为组织损伤信号的HMGB1,除在组织损伤局部招致吞噬细胞发挥早期抗感染作用外,在慢性免疫炎症损伤过程中,也可通过对免疫细胞的调节作用参与和加重炎症损伤程度,构成RA病理过程的一部分。这为进一步研究HMGB1在RA中的作用和探讨基于HMGB1干预的治疗途径奠定了基础。