泡桐丛枝病(Paulownia witches’broom,)由泡桐丛枝植原体(Paulownia witches phytoplasma)侵染引起,该病遍布我国各泡桐栽培区,分布于陕西、河北、山东、河南、安徽、湖南、湖北、江苏、浙江、江西等地,严重地区发病率达80%以上,是泡桐生产上最重要的病害之一。据1990年统计,全国丛枝病发生面积达88万公顷,直接造成的经济损失超过亿元。因此,对泡桐丛枝病防治的研究是泡桐生产中长期亟待解决的问题。由于植原体在寄主体内含量低,又无法进行分离培养,致使对该病原物的研究受到了一定的限制,因此,本文用分子生物学方法对泡桐丛枝植原体进行了分子生物学检测,分离和克隆了与致病有关的免疫膜蛋白基因。研究结果如下:(1)用分子生物学方法对采自全国六个省区自然发病的泡桐丛枝病植株进行植原体16S rDNA基因片段和延伸因子(EF- Tu)tuf基因的扩增,将所得序列进行同源性比较,结果表明,我国大陆泡桐主栽区陕西、山西、甘肃、河南、河北、山东各省与已经报道的台湾省泡桐丛枝植原体基本一致,均为同一个种,没有株系的分化,全部归属于植原体16S r I-D组。16S rDNA和tuf基因的序列均已提交GenBank,序列登录号依次为DQ851169和DQ851170。(2)根据已发表的洋葱黄化植原体全基因组序列设计特异性引物,从泡桐丛枝植原体中分离并克隆了免疫抗原膜蛋白Amp基因(PaWB-amp),其长696bp,GC含量为32.5%,编码231个氨基酸。所测序列已被Genbank收录,登录号为DQ515794。对泡桐丛枝-陕西株系(PaWB-Shaanxi)、翠菊黄化(AY)和洋葱黄化(OY)植原体Amp核苷酸序列进行比较,同源性达98.39%。利用ANTHEPROT5.0软件对PaWB-amp进行分析,可知该蛋白的分子量为24.7KDa,具有良好的抗原性。二级构象中,螺旋形式占73%,折叠占11%,其余为无规则卷曲占16%,无转角形式。具有两个跨膜区,存在有多个潜在信号肽切割位点,其中末端的第219个氨基酸(甘氨酸)处为最强切割位点,在该蛋白的中部未发现潜在的信号肽切割位点。本试验为进一步研究该蛋白的功能奠定了理论基础,并期望以此为基础揭示植原体的致病机理。(3)分别构建了含有目的基因的原核表达重组质粒pET30-amp、pET30-amp603和pBV221-amp603,转化表达宿主菌培养,在不同条件下诱导后,经SDS-PAGE,结果均未能出现该蛋白的表达条带。说明PaWB-amp对大肠杆菌具有毒性。构建了真核表达载体pPIC9K-AMP,经PCR、酶切和测序鉴定,该序列插入pPIC9K真核表达载体,方向正确。尽管本试验未能将泡桐丛枝植原体Amp基因表达成功,但是这为植原体的免疫主导膜蛋白具有可变性及多样性的观点提供了又一个证据。