荣昌猪白细胞介素-2受体α基因克隆、原核表达及生物活性初探

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T免疫细胞如T细胞、NK细胞、LAK细胞产生的细胞因子IL—2能与经抗原活化的T淋巴细胞表面的受体(IL-2Rα)相结合,诱导T细胞的快速增殖,产生排斥反应。根据Genbank基因序列号为U78317的猪白细胞介素-2受体α设计一对特异性引物,经刀豆蛋白素A(conA)诱导培养的荣昌猪外周血淋巴细胞(PBMC)并提取总RNA,RT-PCR方法首次扩增出荣昌猪IL-2Rα的全长基因,共813bp。利用NCBI网站软件BLAST进行同源性搜索,结果显示其与已公布的3个参考序列(登录号:NM213835.1 AF036005.1 AF052037.1)核苷酸同源性很高,均为98%以上。运用PCR技术从含荣昌猪IL-2Rα开放阅读框序列质粒中扩增其成熟蛋白编码基因共774bp。利用基因重组技术构建了PET32a(+)/IL-2Rα融合表达载体,经酶切鉴定,DNA测序证实重组质粒构建正确。将重组质粒转化大肠杆菌BL21,IPTG诱导,SDS-PAGE结果显示表达的融合蛋白约为45KD,Western blotting结果表明融合表达成功。并检测其可溶性,试验确定荣昌猪IL-2Rα重组成熟蛋白表达的最佳条件为IPTG 0.2 mmol/L,37℃诱导培养4h。重组蛋白以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的42.6%。对小白鼠进行免疫试验,测定其CD3+、CD8+、CD4+.用所构建的重组表达质粒pcDNA-mpIL-2Rα免疫的小鼠的数量高于空质粒pcDNA-3.1(+)对照组、空白对照组和无任何试剂组。表明白介素-2受体α有一定的生物活性。本实验首次克隆出荣昌猪IL-2Rα基因并通过对基因序列改造后表达出融合蛋白,这为进一步研究荣昌猪IL-2Rα在体内外的作用和生理活性及在疾病、疫苗免疫中的作用提供了条件,同时对荣昌猪IL-2Rα深入研究可以为荣昌猪作为免疫移植的供体提供参考。
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