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背景:达托霉素为新型环脂肽类抗生素,是治疗由革兰氏阳性耐药菌株所引起感染的最佳治疗药物,因其对MRSA（耐甲氧西林金黄色葡萄球菌）、VRE（耐万古霉素的肠球菌）和PRSP（耐青霉素的肺炎链球菌）等高致病临床耐药菌株有很好的杀菌作用,因此被誉为“超级抗生素”。达托霉素是由玫瑰孢链霉菌S.roseosporus NRRL 15998通过非核糖体肽合成酶（NRPS）所产生的环脂肽类抗生素复合物中很小的一个组分。由于其在临床上重要的应用价值,且在玫瑰孢链霉菌中产量很低,不能满足临床治疗和生产的需要,促使我们研究达托霉素的合成调控机制,通过代谢工程和合成生物学方法来提高达托霉素产量。Arg R是细菌中普遍存在的调控精氨酸代谢的调控因子,在调控精氨酸代谢的同时也能调控其他代谢途径相关基因的表达。在链霉菌中,Arg R是精氨酸生物合成基因的调控因子。精氨酸或参与精氨酸生物合成的氨基酸是众多次级代谢产物合成的前体,因此Arg R广泛调控次级代谢的生物合成;Arg R在棒状链霉菌中参与嘌呤、棒酸的代谢调控及全霉素的生物合成;在天蓝色链霉菌中参与次级代谢过程中色素的合成和相关基因的转录调控;精氨酸生物合成的中间产物鸟氨酸是达托霉素的重要前体,Arg R是否调控达托霉素的合成及其分子机制是一个重要的科学问题。目的:利用蛋白质组学方法比较野生型与两株不同来源的达托霉素高产菌株,发现在两株高产菌株中Arg R的表达显著下调,Arg J表达也下调,而Arg G表达上调,暗示Arg R可能影响达托霉素生物合成,本研究旨在S.roseosporus NRRL 15998中阐明Arg R对达托霉素生物合成机制的调控作用,Arg R对发育分化及次级代谢抗生素生物合成的影响,为解析Arg R在玫瑰孢链霉菌中的生物学功能、调控分子机制和提高达托霉素产量提供依据。方法:1.对S.roseosporus基因组序列进行生物信息学分析,在玫瑰孢链霉菌基因组中确定编码精氨酸抑制因子Arg R的基因argR;利用Clustal X、ESpript软件对Arg R蛋白的同源性进行比对;对Arg R蛋白的保守结构域进行初步预测;2.为研究S.roseosporus中argR的功能,在本实验室构建的玫瑰孢链霉菌Fosmid文库的基础上,通过PCR-targeting方法,利用同源重组的原理在S.roseosporus中构建argR敲除菌株,以p SET152-kan载体出发构建遗传互补菌株,以p IJ8660-erm E*p载体出发构建过表达菌株;3.为在S.roseosporus中研究argR对发育分化的影响,在不同培养基和含有不同金属离子的AS-I培养基中对玫瑰孢链霉菌菌丝发育分化进行研究,比较突变菌株和野生型菌株之间表型的差异来研究argR对发育分化的影响;4.通过实时荧光定量PCR（q RT-PCR）实验探究S.roseosporus中argR对精氨酸生物合成基因簇两个转录单元转录水平的影响;通过半定量PCR（RT-PCR）实验探究S.roseosporus中argR是否能够激活基因组中沉默基因簇的表达;5.为研究argR对次级代谢生物合成的影响,对野生型、敲除株、回补株及过表达株进行了发酵实验,以藤黄微球菌为指示菌对发酵液的生物活性进行了检测;绘制菌体生长曲线和抗生素产量的实时曲线。通过q RT-PCR实验进一步证实argR对次级代谢达托霉素生物合成的转录调控作用;6.构建Arg R蛋白表达载体p ET23b-Arg R,纯化Arg R蛋白,通过EMSA实验初步探究Arg R蛋白对精氨酸生物合成基因簇及达托霉素生物合成基因簇中关键基因的结合能力;结果:1.在S.roseosporus中确定argR在基因组中的位置为SSGG00667。以Fosmid文库质粒为基础,在S.roseosporus中成功构建argR的敲除株argRDM、互补株argRDMC和过表达株argROE;2.在固体培养基和液体培养基中观察WT、argRDM和argROE生长状况,发现菌丝表型没有差别,产孢及产色素情况没有差异,WT和argRDM能在含有0.25M钙离子的培养基中产孢,而argROE几乎不产孢,且argRDM的产孢量是WT的170倍,并用扫描电镜观察证实argR敲除后能够促进菌丝分化;3.S.roseosporus中argR敲除后使A21978C产量降低21%,而过表达使次级代谢抗生素的产量提高1.6倍;4.与WT相比argRDM能够使调控达托霉素产量的关键基因atr A、dpt E、dpt R2和dpt R3的转录水平在48h分别降低26%、21.36%、73.28%和27.12%,72h分别降低51.15%、75.45%、77.88%和29.82%,96h分别降低65.87%、25.09%、15.07%和18.75%,而调控精氨酸生物合成的两个转录单元arg CJBDR和arg GH的转录水平平均提高60倍和100倍左右;5.构建Arg R蛋白表达载体p ET23b-Arg R,并纯化Arg R蛋白,浓度为8mg/m L;6.通过EMSA实验证实Arg R对atr A、dpt E、dpt R2、dpt R3、arg CJBDR和arg GH都有不同程度的结合作用;7.在S.roseosporus中argR基因的突变不能够激活特定沉默基因簇中基因的表达;8.对WT、argRDM菌体和发酵液中氨基酸含量进行检测发现丝氨酸含量分别降低39.72%和13.1%,精氨酸含量分别升高77.44%和180.43%;结论:本研究结果显示S.roseosporus中argR对菌丝生长发育没有显著的影响,在钙离子丰富的培养基中能够显著影响孢子产量;argR能够影响次级代谢抗生素的生物合成,即argR能够影响初级代谢过程中前体丝氨酸的合成而调控达托霉素的产生;并且argR能够调控关键基因dpt E、dpt R2、dpt R3和atr A的转录水平而间接调控达托霉素的合成;argR不能够激活S.roseosporus中特定沉默基因簇中基因的表达;在S.roseosporus中argR能够影响精氨酸生物合成转录单元的转录;我们首次探索argR在S.roseosporus中的功能,这为后续研究argR的功能及S.roseosporus进行代谢工程的改造奠定了坚实的基础。