论文部分内容阅读
研究背景及目的:以动脉粥样硬化为基本组织病理改变的血管损伤性病变,其基本病理进程为:血管损伤引起血管修复和重塑,继而血管内膜增厚,导致管腔狭窄。在这一病变过程中,血管平滑肌细胞通过表型转换、增殖、迁移以及干细胞分化两种方式参与其中。既往研究已经发现microRNA-214(miR-214)调控成熟血管平滑肌细胞功能和表型转换,然而对于其在干细胞向血管平滑肌细胞分化中的作用尚不是十分清楚。本研究希望揭示miR-214在胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化中的作用,鉴定miR-214的靶基因,阐明其作用机制。研究方法:本研究主要利用课题组前面建立的、稳定的、体外的小鼠胚胎干细胞向平滑肌细胞分化模型,观察miR-214表达变化,并过表达或抑制miR-214表达,研究miR-214对胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化的作用。其次,利用生物信息学技术分析及萤光素酶基因报告系统等多种方法鉴定及确认miR-214的功能性靶基因。再者,利用免疫共沉淀(IP)、双荧光素酶基因报告系统等多种分子实验技术,证明QKI对胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化的作用及作用途径。最后,利用体外转染的细胞打入动物体内模拟在体环境的小鼠胚胎干细胞分化模型,研究miR-214对胚胎干细胞向平滑肌细胞分化的影响。结果:利用课题组以前建立的模型,小鼠胚胎干细胞在CollagenIV的刺激下能够稳定的分化成血管平滑肌细胞,并且随着时间的推移,平滑肌标志基因(SM-22α、SM-MHC、h1-Calponin)等表达增多。在此过程中,miR-214表达显著上升趋势。在功能研究实验中,过表达miR-214能够显著促进血管平滑肌细胞标志基因在mRNA和蛋白水平的表达,而抑制miR-214表达则降低平滑肌标志基因的表达。多个miRNA的生物信息学分析数据库分析软件预测QKI是miR-214最有可能的的靶基因之一。在分化中的小鼠胚胎干细胞上,过表达miR-214能够在mRNA和蛋白水平下调QKI表达,而抑制miR-214引起QKI表达水平升高。荧光素酶基因报告实验表明,过表达miR-214能够显著降低含有QKI3’UTR的荧光素酶活性,抑制miR-214能够相应引起QKI 3’UTR的荧光素酶活性在一定程度上升高。而对QKI 3’UTR中miR-214潜在结合位点进行突变后,miR-214对荧光素酶活性的抑制作用消失。miR-214过表达模拟物和QKI过表达质粒共同转染细胞,发现高表达QKI可消除过表达的miR-214对小鼠胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化的促进作用。同时,分别过表达和抑制QKI,发现过表达QKI能够降低血管平滑肌细胞标志基因的mRNA和蛋白表达,抑制QKI表达则具有相反的作用。进而,IP显示,QKI能够直接结合在平滑肌细胞分化关键转录因子的启动子序列。最后,在成功建立的小鼠胚胎干细胞在体分化模型中,发现miR-214能够促进平滑肌分化标志基因的表达,在一定程度上从体内实验层面验证了 miR-214促进鼠胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化。结论:本研究成功揭示了 miR-214在胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化中的新功能。miR-214促进胚胎干细胞向血管平滑肌细胞分化。QKI是miR-214的功能性靶基因,能够直接结合在平滑肌分化关键转录因子的启动子区域,从而抑制分化。miR-214直接结合QKI mRNA的3’UTR区域,下调QKI表达,并通过调控QKI影响干细胞向血管平滑肌细胞分化。miR-214可能是防治平滑肌细胞相关血管损伤性疾病的新靶点。