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目的:观察mTOR抑制剂依维莫司(Everolimus,RAD001)对U251细胞增殖、自噬的影响;同时探讨RAD001联合替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)对U251细胞增殖、自噬的影响;为RAD001在人恶性胶质瘤治疗方面提供可靠的理论依据。方法:本实验分为两个部分。第一部分我们通过体外实验探讨RAD001对U251细胞增殖、自噬的影响。首先,我们采用了CCK-8法检测不同工作浓度的RAD001在不同时间段对U251细胞增殖抑制的影响。使用透射电镜观测经RAD001处理后U251细胞内部超微结构的改变。采用免疫荧光观测经RAD001处理后的人胶质瘤细胞GFP-LC3融合蛋白的分布情况。再通过Western Blot检测RAD001对细胞内LC3B、Becli n-1、P62蛋白水平的影响。第二部分我们通过体外实验探讨RAD001联合TMZ对U251细胞增殖、自噬的影响。我们将U251细胞随机分为下列三组:空白对照组、TMZ单药组以及RAD001与TMZ联合组,采用CCK-8法了解各组细胞生长抑制情况;应用透射电镜观测空白对照组、TMZ单药及联合给药对U251细胞超微结构的改变;采用免疫荧光染色观察空白对照组、TMZ单药及两药联合处理后GFP-LC3融合蛋白的荧光分布情况;采用Western Blot检查空白对照组、TMZ单药及两药联合处理后LC3B、Beclin-1、P62的表达水平。结果:第一部分:U251细胞经过不同浓度RAD001(0、5、10、20、40μM)分别处理(12、24、48h)后,CCK-8检测结果示:RAD001可以有效抑制胶质瘤细胞的生长增殖,并呈现出明显的剂量及时间依赖性;40μM RAD001作用U251细胞48h后,透射电子显微镜可见大量双层膜结构及内含残余细胞器的自噬体和空泡单膜的自噬溶酶体;以浓度为20μM、40μM RAD001分别作用U251细胞48h后,荧光显微镜下可以观看到自噬蛋白表达的绿色荧光斑点;同时发现高浓度组的荧光斑点数量较低浓度组明显更多;以RAD001(0、5、10、20、40μM)分别处理U251细胞48h,Western Blot结果示,自噬蛋白LC3-II、Beclin-1的表达水平及LC3-II/I比值呈剂量依赖性上调,P62的表达水平则逐渐下降。第二部分:各加药组都以浓度依赖性的方式抑制U251细胞生长。联合处理组的抑制率远高于各浓度TMZ单药组,结果具有显著的统计学差异(P<0.05);透射电镜下可观察到联合组中形成的自噬小体比TMZ单药组更多;荧光显微镜下观察发现空白对照组未见绿色荧光斑点,TMZ单药组可见较多的绿色荧光斑点,联合组可见大量的绿色荧光斑点;Western Blot结果表明联合组与TMZ单药组及空白对照组比较,LC3-II/I的比值明显更高,Beclin-1蛋白水平显著上升,而P62蛋白水平则明显下调。结论:1.RAD001具有抑制胶质瘤细胞的生长增殖及促进细胞自噬的作用。2.RAD001联合TMZ对胶质瘤细胞的增殖抑制作用及诱导细胞自噬能力明显优于TMZ单独处理;RAD001能够增强TMZ对胶质瘤细胞的药物敏感性;而且RAD001与TMZ联用具有协同效果。