目的：通过体外连续传代培养，建立具有正常生物学特性和功能的人角膜缘上皮细胞系，为角膜上皮细胞的研究和组织工程化角膜的构建提供种子细胞。 方法：取材中山眼科中心角膜移植术后剩余的无菌角膜缘组织，利用消化培养法，组织块培养法和饲养层培养法，体外培养和纯化人角膜缘上皮细胞。经过连续传代培养，建立人角膜缘上皮细胞系。通过下列方法进行细胞系的鉴定：①通过光镜、电镜，观察细胞在传代过程中形态学特征，用常规方法进行细胞冻存和复苏，观察复苏效率；②通过MTT法绘制细胞生长曲线，计算群体倍增时间，掌握其生长和增殖规律；③通过有限稀释法检测细胞的克隆形成力，并挑取单克隆，体外扩增和纯化细胞系；④通过流式细胞技术进行细胞DNA倍体分析及周期检测，观察传代细胞DNA和细胞周期的变化；⑤通过间接免疫荧光细胞染色、westem blot、反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)等方法检测细胞蛋白表达：包括转录因子P63，角膜上皮细胞特异性蛋白角质蛋白(cytokeratin)CK3和CK12的表达，同时检测CK19，CK14，波形蛋白(Vimentin)，微丝蛋白(F-actin)，微管蛋白(β-tubilin)和β1整合素(β1-integrin)等蛋白在细胞系中的表达情况；⑥对染色体进行核型分析，观察细胞在传代过程中核型的变化；⑦利用双琼脂细胞克隆形成实验对细胞进行固着非依赖性生长分析(Anchorage independentgrowth assay)；将不同代数角膜缘上皮细胞接种到Balb/c裸小鼠皮下组织，观察有无致瘤性，评价细胞的生物安全性；⑧将细胞接种在Transwell培养皿中进行气液界面培养2周，观察细胞系的体外复层形成能力。 结果：采用组织块培养法成功建立了一株人角膜缘上皮细胞系(spontaneously derived human corneal epithelial cell line-SDHCEC1)。细胞在体外连续传代已超过50代，经过鉴定后，细胞系具有以下特征：①形态特点：细胞呈圆形、椭圆形，细胞表面可见丰富的微绒毛。细胞浆内可见大量的粗面内质网，核糖体，微丝和微管等细胞合成、分泌旺盛的上皮细胞表征。按照常规方法进行保存的细胞在-196℃冻存6个月之后，复苏后活细胞比率大于85﹪。②细胞生长动力学分析：细胞倍增时间为19.6小时，细胞在接种后24小时后进入对数生长期，细胞增殖旺盛，状态良好。③克隆特点及形成率：体外培养的人角膜缘上皮细胞的克隆形成率维持在5-6﹪左右。早代细胞(P<10代)形成的克隆小而紧密，后代细胞的克隆则比较松散，细胞的迁移性增加。④细胞在传代培养过程中，S期细胞的比例分别为23.2﹪、7.5﹪、6.1﹪、17.5﹪、11.4﹪、7.7﹪(P1-P50每隔十代)；DNA倍体分析表明细胞DNA含量向多倍体和异倍体发展。⑤SDHCEC1细胞表达角膜上皮细胞特异性蛋白CK3和CK12，同时还表达角膜缘上皮细胞的其他蛋白如CK19、CK14、Vimentin、F-actin，β-tubilin和β<,1>-integrin蛋白，而无P63蛋白的表达。⑥核型分析表明：细胞系的染色体核型为多倍体，异倍体，染色体在细胞长期传代培养过程中发生了断裂和重组。⑦SDHCEC1细胞和阴性对照组P3人角膜缘上皮细胞在双琼脂克隆形成实验中均不能形成有效克隆(单克隆细胞数>5)，而33.2﹪视网膜母细胞瘤细胞-RB细胞(阳性对照组)在相同的条件下中可以形成有效克隆。细胞接种于裸鼠皮下80天后，未见有肿瘤生长。⑧采用气液界面培养法培养SDHCEC1细胞2周，可形成3-4层复层角膜上皮。 结论：采用组织块培养法，通过连续传代培养，结合人角膜缘上皮细胞在传代培养不同时期的生长特点改良培养技术，成功建立了一株人角膜缘上皮细胞系-SDHCEC1。SDHCEC1细胞系的建立避免了对细胞的基因操作，细胞在体外长期传代的过程中能够保持角膜上皮细胞的形态学、生长动力学、蛋白表达和复层形成能力，并且细胞系安全无致瘤性。为角膜上皮细胞增殖和分化的基因调控，细胞外基质的合成，生长因子的作用，药物的开发和毒性检测等角膜上皮细胞的研究提供细胞来源，也可为构建组织工程化生物角膜提供种子细胞。