论文部分内容阅读
目的:糖尿病肾脏病(DKD)是终末期肾病的主要原因。尽管我们在DKD的治疗措施上已有很大的改进,仍有50%的DKD患者将发展为终末期肾病,因此,深入研究DKD的发生发展机制以寻找新的干预靶点即具有重要意义。研究发现葡萄糖6磷酸脱氢酶(G6PD)活性下降及其下游NADPH的水平生成减少可能参与了 DKD的发病,但机制不明。正常情况下,近端肾小管上皮细胞可内吞肾小球滤过液中的白蛋白,一方面进行白蛋白的回吸收利用,另一方面减少白蛋白对肾小管上皮细胞的损伤。我们前期研究发现,自噬下调使肾小管上皮细胞内吞白蛋白的功能减弱;而有研究发现G6PD与细胞自噬功能下降有关。那么G6PD下调是否也通过抑制自噬参与了近端肾小管上皮细胞的功能损伤?另一方面,G6PD下调的原因是什么?MicroRNA是一类长度约20-24个核苷酸的小分子非编码RNA,它的作用机制是通过与靶基因的mRNA结合而降解靶基因或抑制靶基因的翻译从而起到基因调控作用。大量研究发现糖尿病及DKD患者的尿液mi croRNAs表达谱发生明显变化,且参与了糖尿病及其并发症的发生发展。因此我们推测糖尿病环境下异常升高的microRNA可能是肾脏G6PD表达量及活性下降的原因,为此本研究首先对DKD患者尿液筛选差异microRNAs表达谱,找出了可靶向抑制G6PD的microRNA-7977,并在ZDF糖尿病肾病大鼠肾组织中进行了验证;然后利用肾小管上皮细胞,研究microRNA-7977对G6PD的靶向调控作用,分析G6PD与白蛋白诱导自噬的关系。方法:(1)临床研究:入选健康对照者(normal control,NC)、2型糖尿病患者(Type 2 diabetes mellitus,T2DM)、2 型糖尿病肾病患者(Type 2 diabetic nephropathy,DKD),采集三组患者的基本信息,生化法检测空腹血糖、糖化血红蛋白、血脂、肝肾功能,采集24小时尿液标本、晨尿标本,生化法检测24小时尿微量白蛋白(UMA)、β 2-微球蛋白(β 2-microglobulin β 2-MG)、转铁蛋白(Transferrin TF)、免疫球蛋白 G(Immunoglobulin G IgG)、N-乙酰-β-氨基葡萄糖苷酶(N-acetyl-beta-D-glucosaminidase NAG)、视黄醇结合蛋白(Retinol binding protein RBP)α-半乳糖苷酶(alpha-galactosidase GAL),比较各组患者肾小管损伤指标的差异,并检测各组患者血清、尿液G6PD酶活性。同时,根据课题组前期已经确定的DKD患者的尿液差异microRNA表达谱,通过target scan找出可靶向降解G6PD的microRNA,并应用RT-qPCR法在人群中扩大样本量对其进行验证。(2)动物实验:本研究以自发性2型糖尿病大鼠(ZDF大鼠)为研究对象,给予高脂饲料诱导喂养,分为对照组、糖尿病组、糖尿病肾病组,记录其体重、24小时进食量、24小时饮水量、24小时尿量,生化法测血糖、糖耐量、血脂、肝肾功能,24小时尿微量白蛋白,HE染色观察肾脏病理情况,应用分光光度法测G6PD活性,Western blot法测G6PD及自噬指标P62、Beclin-1的蛋白表达量,RT-qPCR法检测mir-7977的表达水平,比较不同组G6PD表达、活性的差异,比较不同组自噬水平的差异。(3)细胞实验:体外培养人源近端肾小管上皮细胞(HK-2),分别在不同浓度白蛋白(0mg/mL、0.5mg/mL、10mg/mL)及高浓度葡萄糖(33.3mmol/L)加白蛋白(0.5mg/mL)中进行培养,以 RT-qPCR、Western blot 法检测 mir-7797、G6PD、P62、Beclin-1的表达量,进一步使用mir-7797的抑制剂和激动剂干预细胞后检测G6PD的表达,用腺病毒载体和小干扰RNA(siRNA)分别过表达和敲减G6PD,分析mir-7977/G6PD信号通路对肾小管上皮细胞中白蛋白诱导的自噬的影响。结果:(1)人群研究结果1.与NC组相比,T2DM组、DKD组空腹血糖及糖化血红蛋白、低密度脂蛋白均明显升高(P<0.05);肝肾功能无明显差异(P>0.05),与T2DM组相比,DKD组24小时UMA明显升高,与NC组相比,T2DM组β 2-MG、NAG、IgG、GAL明显升高,与 NC 组、T2DM 组相比,DKD 组 β 2-MG、TF、IgG、RBP、GAL、NAG 明显升高,差异有统计学意义。(P<0.05)。2.用分光光度法测三组人群血液尿液G6PD酶活性,与健康对照组相比,T2DM组、DKD组患者血液G6PD酶活性显著下降(P<0.05),尿液中酶活性变化趋势与血液一致;而与T2DM组相比,DKD组患者尿液酶活性进一步下降(P<0.05)。3.用TargetScan软件分析显示可靶向结合G6PD的microRNAs包括has-miR-6829-5p、has-miR-6845-5p、has-miR-7977,其中在 T2DM 组和 DKD 组中持续升高的microRNA有mir-7977,我们进一步扩大样本量,验证了 DKD患者尿液中mir-7977相对于NC组及T2DM均升高(P<0.05)。(2)动物研究结果:1.三组大鼠血糖在基线水平无明显差异,T2DM组大鼠体重随周龄逐渐增长,均明显大于对照组;9周时开始出现多饮、多食、多尿的症状;在12周时,T2DM组和DKD组血糖明显高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。2.随病情进展,与健康对照组比较,糖尿病大鼠OGTT试验糖负荷后各时间点血糖均增加,其曲线下面积(AUC)也增加,甘油三酯及低密度脂蛋白明显升高(P<0.05),12周时DKD组24小时UMA明显升高,差异有统计学意义(P<0.05);三组之间肝肾功能无明显差异(P>0.05)。3.与NC组相比,T2DM组、DKD组肾皮质中G6PD和Beclin-1的蛋白表达量均降低,P62的表达量升高,G6PD酶活性显著降低,而mir-7797的表达量升高,差异有统计学意义(P<0.05)。(3)细胞实验:1.用白蛋白干预肾小管上皮细胞之后,G6PD的表达量和活性均升高,自噬指标P62表达量下降,Beclin-1的基因及蛋白表达量升高(P<0.05),以siRNA敲减G6PD后,自噬水平降低(P<0.05),提示正常情况下,G6PD可通过上调自噬而增加细胞内吞白蛋白的能力。2.以高糖加白蛋白干预肾小管上皮细胞之后,mir-7797的表达量明显升高,G6PD表达量及活性下降,P62表达量升高,Beclin-1的蛋白表达量下降(P<0.05),而以mir-7977 inhibitor处理后,G6PD的表达量及活性上升,另一方面以腺病毒过表达G6PD后,自噬水平也明显改善(P<0.05)。提示高糖环境下mir-7977可靶向降解G6PD,从而抑制细胞自噬功能,导致肾小管上皮细胞内吞白蛋白能力下降。3.双荧光素酶结果显示mir-7797可以与G6PD靶向结合,且mir-7797的抑制剂能上调G6PD而mir-7797激动剂下调G6PD。结论:正常情况下,肾小管腔中的白蛋白可通过上调G6PD诱导细胞自噬而促进细胞内吞白蛋白,从而保护肾小管上皮细胞的功能,预防蛋白尿的发生;而高血糖通过上调mir-7977,抑制了 G6PD/自噬信号通路,从而抑制了肾小管上皮细胞对白蛋白的处理能力,引起了肾脏损伤。