病毒性腹泻一直是困扰生猪养殖的重要疾病之一,疾病主要引起一周龄以内的仔猪呕吐、水样腹泻和脱水死亡。猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)是致仔猪死亡的头号杀手,感染率高达60%,死亡率可达100%;猪德尔塔冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)为仅次PEDV的猪肠道致病原,其感染率高达30%,死亡率高达50%以上。猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome coronavirus,SADS-CoV)又名猪肠道阿尔法冠状病毒(porcine enteric alphacoronavirus,PEAV)/猪肠道α冠状病毒(Se A-CoV),是2017年初新发现的一种新型致病性肠道冠状病毒,临床发病时间比PEDV稍晚2-3天,临床症状也相较于PEDV要轻。中国是生猪养殖大国,年出栏生猪达7亿头,然后却未见对于南方地区PEDV、PDCoV、SADS-CoV流行病学和基因的遗传变异的长期观察,且临床上存在大量PEDV和PDCoV混合感染的病例,其致病机制尚未明晰。为此本研究主要针对以下几个方面进行研究:1、南方地区PEDV、PDCoV和SADS-CoV的流行情况调查及S1基因的遗传变异情况从江西、浙江、福建、广东、湖南五省份采集了2012-2019年间3051份粪便、小肠组织及母乳样品,使用本实验建立的RT-PCR方法对样品中PEDV、PDCoV、SADS-CoV进行流行病学调查,结果表明:PEDV阳性率最高,阳性率为57.06%;其次为PDCoV,阳性率为27.14%;SADS-CoV的阳性率最低,仅为0.23%,且仅福建地区的样品中检测出了SADS-CoV阳性样品的存在。在2012-2019年间,PEDV的阳性率一直维持在较高水平,2013年PEDV的阳性率最高,达62.13%,而2019年的PEDV阳性率最低,为45.31%;PDCoV的阳性率在2018年最高,2012年最低;而SADS-CoV仅在2017年福建采集的68份样品有检出,总阳性率为0.23%。在混合感染的样品中,PEDV和PDCoV混合感染样品数最多,最高可占17.33%;而在PDCoV阳性样品中,PEDV和PDCoV混合感染率最高为70.97%,最低为2014年的样品,为30.57%。挑选11株不同年份PEDV阳性样品进行的S1基因进行核苷酸与氨基酸进化树分析,结果表明:所扩增的PEDV S1基因均属于G IIa分支,证明华中地区主要流行G IIa毒株;且具有A518S、G521D、L522H/Y、S524G、V528I、T550S、S563F、G594S、A605E、L612F、F617L、K630T、E633V和I635V的突变为位点。挑选的8株PDCoV氨基酸进化树分析发现:扩增的PDCoV毒株以及所有中国毒株(AN-2004除外)和泰国毒株(TT＿1115)在N52处均具有氨基酸缺失。扩增的SADS-CoV-CH-NDFJ-2018S1基因与Gen Bank中41株参考株的核苷酸同源性均在97.2%-100%之间,氨基酸同源性在98%-100%;其中与SADS-CoV-CH-FJWT-2018(MH615810)毒株的同源性最低,与SADS-CoV＿GDLX/2019(MK651076)同源性最高。2、PEDV、PDCoV与SADS-CoV感染IPEC-J2细胞的生物学特性研究以IPEC-J2细胞为感染模型,使用PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一/共感染IPEC-J2细胞,通过数据统计发现,PEDV单一感染IPEC-J2病毒拷贝数比PEDV+PDCoV及PEDV+SADS-CoV共感染中PEDV的拷贝数显著增加,说明共感染抑制/影响PEDV病毒的增殖。在PEDV+PDCoV共感染中PEDV的病毒拷贝数比PEDV+SADS-CoV共感染中PEDV的拷贝数显著降低,说明在共感染中PDCoV比SADS-CoV对PEDV增殖的影响要更为强烈。而PDCoV与PEDV或SADS-CoV共同感染时PDCoV的病毒拷贝数显著高于PDCoV单一感染时拷贝数,类似的现象在SADS-CoV病毒单一及与PEDV或PDCoV共感染中观察到。通过细胞免疫荧光还发现,不同病毒可以感染同一细胞,不存在排斥现象。3、PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染转录组学比较研究通过转录组学分析PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染IPEC-J2细胞后宿主基因差异性表达情况,进一步揭示PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染的病毒致病机制和宿主的抗病毒机制的差异。在与PEDV的共感染与单一感染对比中,PEDV+SADS-CoV共感染在前期比PEDV+PDCoV共感染会引起细胞更加强烈的免疫反应,而PEDV+PDCoV共感染在后期诱导的炎症免疫反应强于PEDV+SADS-CoV;对表达差异基因进行生物信息分析发现,PEDV+SADS-CoV差异基因主要富集在细胞进中的氨基化合物的生物合成进程(amide biosynthetic process)、ATP生物合成进程(ATP biosynthetic process)和ATP代谢进程(ATP metabolic process)均显著升高,而在PEDV+PDCoV差异基因主要富集在固有免疫应答(innate immune response)、固有系统应答(immune system process)和免疫应答(immune response)中。在与PDCoV的共感染与单一感染对比中,PDCoV+SADS-CoV和PDCoV+PEDV共感染均随着感染时长的增加,差异基因数均不断上升;对表达差异基因进行生物信息分析发现,PDCoV+SADS-CoV比PDCoV+PEDV引起的细胞信号通路的变化更为显著,且聚类的通路有所差异。在24h时,PDCoV+SADS-CoV差异基因富集中固有免疫应答(innate immune response)、细胞因子应答(response to cytokine)、肿瘤坏死因子应答(response to tumor necrosis factor)等最显著,而PDCoV+PEDV差异基因富集中免疫系统进程、免疫应答、固有免疫应答等最显著。在与SADS-CoV的共感染与单一感染对比中,SADS-CoV+PDCoV共感染均随着感染时长的增加,差异基因数不断上升,而SADS-CoV+PEDV共感染组在48h时差异基因数有所下降。对表达差异基因进行生物信息分析发现,通过对不同时间点,对比SADS-CoV单一感染组与SADS-CoV和PDCoV共感染组GO富集分析:在6 h和24 h时,均无显著差异性通路富集;在48h时,有281个差异基因显著富集到细胞组分,仅微管细胞骨架(microtubule cytoskeleton)、细胞核(nucleus)、微管形成中心(microtubule organizing center)和中心体(centrosome)通路差异显著。对比SADS-CoV单一感染组与SADS-CoV和PEDV共感染组GO富集分析:在6 h时,有38个富集通路显著差异,其中病毒免疫应答相关通路差异显著,涉及的相关差异基因为RSAD2、MX1、DDX58、MX2、STAT1、OAS1、STAT2、CD40、IRF1、CCL5、ISG20等;在24 h和48 h没有发现显著差异富集通路。我们首次对通过转录组学分析PEDV、PDCoV、SADS-CoV单一感染和共感染IPEC-J2细胞后宿主基因差异性表达情况,研究结果为深入了解单一感染和共感染对宿主免疫应答机制的改变提供基础。4、TLR3通路对PEDV、PDCoV、SADS-CoV的影响TLR3是一种病原的模式识别受体,识别病毒感染产生的双链RNA结构后,通过诱导I型干扰素和促炎性细胞因子的生成,抑制病毒的复制。在进行转录组富集分析发现TLR3通路在单一感染和共感染组均出现显著上调。本实验在病毒感染前后使用poly(I:C)刺激IPEC-J2细胞发现,病毒感染前12h刺激对病毒复制的抑制效果更为显著;而使用BX795抑制TLR3通路的激活,可以促进病毒的复制。为了进一步确定是由于病毒感染激活TLR3引起宿主的免疫应答反应,使用pCAGGS-TLR3过表达质粒和pCDNA3.1-U6-TLR3干扰质粒分别转染IPEC-J2细胞,发现TLR3的过表达抑制了病毒的复制,并且引起了更加强烈的干扰素的产生,反之则降低了TLR3通路的激活促进了病毒的复制。5、PEDV、SADS-CoV和PDCoV结构蛋白与INSIG1相互作用机制在病毒感染宿主细胞的过程中,除了利用病毒自身的蛋白在一定程度上抑制宿主的免疫应答,还能在病毒感染期间调节固醇的合成作为促进脂质筏中病毒复制和病毒出芽的策略。胰岛素诱导基因(Insulin-induced genes,INSIGs)是近年来新发现的调控细胞固醇类物质合成与代谢的主要因子,病毒依靠其细胞宿主为成功复制提供能量和组成元件。为了探究PEDV、PDCoV、SADS-CoV影响胆固醇代谢机制,本实验利用病毒蛋白的过表达重组质粒转染IPEC-J2细胞,研究INSIG1与PEDV、PDCoV、SADS-CoV之间的相互关系。通过实验发现,INSIG1 mRNA水平和蛋白水平在PDCoV感染后期出现显著下调,而PEDV、SADS-CoV则出现显著上调,这促使我们对其感染机制的不同做出更深入研究。在本实验中,INSIG1过表达可以降低腹泻相关病毒的病毒拷贝数;INSIG1敲低可以显著促进病毒的表达。通过共感染的研究发现,与PDCoV的可以在一定程度上促进PEDV和SADS-CoV的增殖。因此,PEDV、PDCoV、SADS-CoV产生的蛋白可能会对INSIG1基因产生抑制作用。过表达三种病毒的结构蛋白和非结构蛋白的研究发现,病毒S蛋白可以显著抑制INSIG1的表达,而其他非结构基因ORF3、NS3、NS6、NS7、NS7a、NS7b可在一定程度上引起INSIG1的上调,存在一定的中和调节作用。这与病毒感染前期,INSIG1出现一定程度的上调有一定关系。为了进一步了解在感染的后期PEDV、SADS-CoV和PDCoV感染的IPEC-J2细胞INSIG1出现显著差异的原因,使用不同浓度的葡糖糖培养基培养三种病毒发现,INSIG1基因的表达水平的变化,依赖于葡糖糖浓度的影响。通过测定胆固醇代谢相关的INSIG1、AMFR、SCAP、SREBF1、INSIG2、DHCR24、LSS、MSMO1、OSBPL8变化水平发现,PDCoV感染组胆固醇合成相关的INSIG1、AMFR、SCAP、SREBF1出现显著下调,氧化固醇结合蛋白样蛋白8(Oxysterol Binding Protein Like Protein,OSBPL8)则显著上调。该研究为PEDV、PDCoV和SADS-CoV的相互作用及病毒和胆固醇代谢建立了新的联系,为将来研究PEDV、PDCoV和SADS-CoV共感染机制提供新的依据。