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目的:
(1)用噬菌体展示技术筛选HSV-2gD的模拟抗原表位;
(2)对筛选的结果应用生物信息学软件DNAStar protean进行蛋白质二级结构和B细胞抗原表位的分析,进一步确定HSV-2gD的模拟抗原表位;
(3)构建人IL-18真核表达载体;
(4)构建HSV-2gD模拟抗原表位的真核表达载体。
方法:
(1)以HSV-2gD单克隆抗体作为固相筛选蛋白,对噬菌体12肽库进行4轮“吸附-洗脱-扩增”的生物筛选,挑取噬斑,用酶联免疫吸附试验(ELISA)鉴定阳性噬菌体克隆,提取阳性噬菌体的单链DNA,进行测序,并分析结果;
(2)应用生物信息学软件DNAStar protean对筛选的结果进行蛋白质二级结构和B细胞抗原表位的分析,进一步确定HSV-2gD的模拟抗原表位;
(3)TRIZOL法提取丙型肝炎病人肝脏组织的总RNA,应用TAKARA逆转录试剂盒将RNA逆转录成eDNA;
(4)以pcDNA3.1-作为真核表达载体,应用DNAStar和Primer Pream软件设计两个目的基因的引物,即人IL-18和HSV-2gD模拟抗原表位;
(5)应用PCR技术扩增目的基因:人IL-18和HSV-2gO模拟抗原表位,并用琼脂糖凝胶电泳检测扩增结果;
(6)应用基因工程技术将两个目的片段分别克隆到PMD-18 T simple vector中;
(7)将两个目的基因克隆到真核表达载体pcDNA3.1-中,构建DNA疫苗。
结果:
(1)通过四轮特异性淘洗,筛选得到11个阳性噬菌体克隆,提取噬菌体单链DNA测序,从测序结果可以看出共有7个序列的同源性较高,其中有两个氨基酸基序即P*PLW和PYH**H出现的机率较高,可能为HSV-2gD的模拟抗原表位;
(2)生物信息学软件分析两个氨基酸基序的代表:即短肽P3和P6,可以确定两者均具有形成模拟抗原表位的可能性;
(3)成功扩增了两个目的片段:600bp左右大小的人IL-18和60bp左右大小的HSV-2gD模拟抗原表位P6;
(4)将人IL-18与PMD-18 T simple vector连接成功。
结论:通过噬菌体展示技术,成功地筛选出了HSV-2gD的模拟抗原表位,经过生物信息学分析可以确定PYH**H和P*PLW都可能是HSV-2gD抗原模拟表位的基序;成功地获得了HSV-2gD模拟抗原表位P6的目的片段,并将人IL-18与T载体连接,为下一步实验奠定了基础。