目的:阿尔茨海默病（Alzheimer’s disease,AD）是多见于老年人群中的一种难治性神经退行性疾病,临床上以渐进性认知功能减退为主要表现,目前尚无有效的治疗药物。脑内淀粉样β蛋白（amyloid-β,Aβ）沉积是AD的一个重要神经病理学特征,也是诱导AD发生发展的主要致病因素。越来越多的研究认为,Aβ的产生和清除之间的不平衡是导致Aβ异常聚集和沉积的主要原因。因此,促进脑内和外周的Aβ清除,是一种有效的AD防治策略。曲古抑菌素A（trichostatin A,TSA）是一种组蛋白去乙酰化酶抑制剂。有证据初步显示,TSA可改善AD模型动物APP/PS1小鼠的条件恐惧记忆以及长时程增强（long-term potentiation,LTP）,提示其具有神经保护作用,但仍缺乏系统的认知行为和病理表现研究,特别是TSA发挥作用的分子机制尚不明确。因此,本研究首先采用旷场、新物体识别和Morris水迷宫等行为学实验,进一步观察了慢性腹腔注射TSA对APP/PS1小鼠的短期识别记忆和长期空间记忆的改善效应;接着,经联合应用免疫荧光、免疫印迹和Simoa技术,研究了TSA对APP/PS1小鼠海马组织中Aβ沉积以及对Aβ清除相关蛋白表达的影响;研究还综合运用免疫共沉淀、质谱以及细胞培养等技术,进一步探究了TSA促进Aβ清除的分子机制。方法:1.小鼠物体识别记忆、空间学习和参考记忆测试实验选用8月龄APP/PS1小鼠及其同窝野生型小鼠（wild-type,WT）。根据小鼠类型和药物处理的不同,将其随机分为以下四组:野生型对照组（WT+Vehicle）、野生型给药组（WT+TSA）、APP/PS1对照组（APP/PS1+Vehicle）和APP/PS1给药组（APP/PS1+TSA）。各组动物在行为学实验前30天起分别接受腹腔注射TSA（2 mg/kg）或等体积的TSA溶剂（Vehicle）,药物注射一直延续至行为学实验结束。药物处理的第31天开始进行三种行为学测试:1.1旷场实验:将小鼠放在旷场中心,让其自由活动10 min。记录小鼠在旷场中的总运动距离和在中央区域活动的时间占总时间的百分比,分析小鼠的自主活动和探索行为。1.2新物体识别实验:包括熟悉期和测试期。在熟悉期,记录10 min内小鼠在旷场探索两个相同物体的时间。间隔6 h后进行测试,将其中一个物体换成颜色与形状均不同的新物体,记录小鼠在10 min内探索新、旧物体的时间,计算新物体识别指数（novel object recognition index,NOI）,评价小鼠的短期物体识别记忆能力。NOI=探索新物体时间/（探索新物体时间+探索旧物体时间）×100%。1.3 Morris水迷宫实验:分为定位航行实验和空间探索实验两个阶段,分别记录小鼠寻找水下平台的逃避潜伏期和撤除平台后小鼠在目标象限内游泳时间百分比和穿越目标平台次数,用于评价小鼠的空间学习和参考记忆能力。此外,通过可视平台实验测试小鼠的视力。在整个实验期间记录小鼠的游泳速度以排除小鼠的运动障碍。2.小鼠海马内AD样病理学特征及Aβ的产生和清除能力检测为避免行为学实验对小鼠产生的刺激性影响,待行为学实验结束后恢复两周,再取出小鼠脑组织进行以下实验:2.1免疫印迹实验:提取的海马组织蛋白经过SDS-PAGE电泳后转至PVDF膜上,封闭,依次孵育一抗、二抗,滴加ECL发光液,显影曝光,运用Alpha View SA软件分析目标蛋白（Aβ、APP、CTF、BACE1、IDE、NEP、LRP1等）的灰度值。2.2免疫荧光实验:将固定后的脑组织进行冰冻切片,厚度为30μm,分别加入一抗、二抗,检测海马内Aβ斑块及小胶质细胞的数量和分布的变化情况。2.3 Simoa实验:采用Simoa平台HD-1测定和分析小鼠血浆和海马组织中Aβ₄₀和Aβ₄₂的含量。3.检测APP/PS1小鼠海马内与Aβ相互作用的蛋白3.1免疫共沉淀实验:在裂解后的海马组织中加入一抗同源性普通IgG和Protein A/G Agarose以去除非特异性结合。在上清中加入6E10抗体和Protein A/G Agarose,离心后弃上清,用PBS洗涤沉淀后弃上清,加入1×SDS-PAGE电泳上样缓冲液重悬沉淀,进行SDS-PAGE电泳。3.2液相色谱-串联质谱（liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS）检测:3.1实验中SDS-PAGE电泳后的凝胶经考马斯亮蓝染色30 min,收集含有目的蛋白的胶块,进行LC-MS/MS分析。4.细胞学实验4.1细胞培养:小鼠小胶质细胞BV2和小鼠脑微血管内皮细胞bEnd.3是常用于AD研究的体外模型细胞。将细胞培养在含10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的DMEM高糖培养基中,并置于含5%CO₂的37℃细胞培养箱中。根据实验需要做相应的处理,分别收集细胞或上清,检测相关指标。4.2检测TSA对BV2细胞中白蛋白（albumin）表达及吞噬Aβ寡聚体功能的影响:4.2.1 BV2细胞接种于六孔板中,给予不同处理时间和不同浓度的TSA处理24 h后,收集细胞、裂解提取蛋白后,进行免疫印迹实验检测TSA对BV2细胞中albumin表达的影响。4.2.2将小鼠albumin与人源性Aβ_1-42在37℃孵育24 h后进行免疫印迹实验和透射电镜实验,观察小鼠albumin对Aβ_1-42聚集程度的影响。并通过Transwell实验观察人源性Aβ_1-42和小鼠albumin对BV2细胞迁移的影响。4.2.3检测TSA对BV2细胞吞噬Aβ寡聚体功能的影响:将BV2细胞接种于六孔板中,并分为:正常对照组（Vehicle）、Aβ₄₂组、Aβ₄₂+TSA组和Aβ₄₂+TSA+ITSA-1（TSA抑制剂）组。药物处理24 h后观察BV2细胞的形态变化,收集细胞并用PBS洗涤多次以去除胞外可溶性Aβ₄₂,通过免疫印迹实验检测胞内albumin、Ac-H4的表达及Aβ水平。4.3将bEnd.3细胞接种于六孔板中,同4.2.3的分组及处理,通过免疫印迹实验检测TSA对bEnd.3细胞中albumin蛋白表达和Aβ含量的影响。结果:1.TSA明显降低APP/PS1小鼠在旷场中的过度活跃状态。小鼠旷场实验结果显示:与WT+Vehicle组小鼠相比,APP/PS1+Vehicle组小鼠在旷场中的总运动距离明显增多（P<0.05）,而在中央区域的时间百分比有升高的趋势,给予TSA治疗后的APP/PS1小鼠总运动距离明显减少（P<0.001）,在中央区域的时间百分比也有下降的趋势。2.TSA可以改善小鼠的短期识别记忆。在新物体识别实验中,四组小鼠在熟悉期对两个相同物体的探索时间没有明显差异（P>0.05）;在测试期,与WT+Vehicle组小鼠相比,APP/PS1+Vehicle组小鼠的新物体识别指数出现明显下降（P<0.01）,经TSA治疗后可以明显提高APP/PS1+TSA组小鼠（P<0.05）的新物体识别指数。此外,TSA治疗也显著提高了野生型对照组小鼠的新物体识别指数（P<0.001）。3.TSA可增强APP/PS1小鼠的空间学习和参考记忆。水迷宫定位航行实验显示,APP/PS1+Vehicle组小鼠第4天（P<0.001）和第5天（P<0.05）的逃避潜伏期与WT+Vehicle组小鼠相比明显延长,给予TSA治疗后明显缩短（P<0.05）。空间探索实验结果显示,相比WT+Vehicle组小鼠,APP/PS1+Vehicle组小鼠在目标象限的停留时间百分比（P<0.05）和穿台次数（P<0.01）明显减少,而TSA治疗后均显著增多（P<0.05）。在水迷宫实验期间,各组小鼠的游泳速度无统计学差异（P>0.05）。4.TSA显著抑制APP/PS1小鼠海马内Aβ水平的升高及小胶质细胞增殖。小鼠海马组织病理学特征检测结果显示:（1）6E10抗体免疫荧光染色和硫磺素S染色检测斑块的结果表明,TSA治疗可使APP/PS1小鼠海马区Aβ斑块数量和面积均明显减少（P<0.05）;（2）6E10抗体和D54D2抗体免疫印迹检测可溶性Aβ的结果表明,与WT+Vehicle组小鼠相比,APP/PS1+Vehicle组小鼠海马组织中Aβ寡聚体显著增加（6E10:P<0.01;D54D2:P<0.001）,而给予TSA治疗后明显降低（6E10:P<0.05;D54D2:P<0.001）;（3）Simoa检测结果表明,APP/PS1小鼠海马组织中可溶性Aβ₄₀（P<0.01）和Aβ₄₂（P<0.05）在TSA治疗后明显减少;（4）Iba 1免疫荧光染色结果发现,APP/PS1小鼠海马区小胶质细胞聚集在Aβ斑块周围,小胶质细胞的数量和面积均显著升高（P<0.001）,给予TSA治疗后则明显减少（P<0.01）。5.TSA不影响Aβ的产生、胞外酶解及LRP1介导的外向转运,但增强了Aβ胞内泛素-蛋白酶体和外周途径的清除。Aβ来源和去路检测实验发现:（1）APP/PS1小鼠海马组织中flAPP表达较WT+Vehicle组小鼠显著升高（P<0.001）,但给予TSA后没有明显变化（P>0.05）,证明APP/PS1小鼠模型构建成功,且TSA不影响APP的表达;（2）CTF和BACE1的表达在四组中差异不明显（P>0.05）,但Aβ/flAPP在Vehicle+APP/PS1组小鼠海马组织中表达明显升高（P<0.01）,给予TSA治疗后有所降低（P<0.05）,说明TSA不是通过抑制脑内Aβ产生来降低Aβ水平,可能是通过促进Aβ清除以减少脑内Aβ的;（3）免疫印迹检测胞外和胞内Aβ清除结果显示,胞外Aβ降解酶IDE和NEP的表达在四组小鼠中并没有明显变化（P>0.05）,胞内自噬相关蛋白p62、Beclin 1的表达及LC3B-Ⅱ/LC3B-I也没有明显差异（P>0.05）,但APP/PS1小鼠海马组织中游离泛素水平较WT+Vehicle组小鼠明显升高（P<0.01）,说明APP/PS1小鼠海马内的泛素-蛋白酶体功能受损而导致游离泛素的大量积累;给予TSA治疗后游离泛素水平显著减少（P<0.05）,提示TSA可能促进泛素-蛋白酶体活性,从而使游离泛素随Aβ降解而减少。这些结果表明,TSA不是通过胞外酶解和胞内自噬-溶酶体,而是通过胞内泛素-蛋白酶体途径清除Aβ的;（4）Simoa检测外周血浆Aβ水平的结果显示,经TSA治疗后APP/PS1小鼠血浆中Aβ₄₀（P<0.01）和Aβ₄₂（P<0.05）的含量明显减少,但Aβ在脑内的外向转运受体LRP1表达没有明显组间差异（P>0.05）,这提示TSA也可能是通过外周清除来降低脑内Aβ水平,但这与LRP1外向转运可能无关。6.Albumin与Aβ的相互作用介导了TSA的清除Aβ效应。在蛋白相互作用研究实验中的结果显示:（1）通过Co-IP和LC-MS/MS及免疫荧光技术证实,APP/PS1小鼠海马内存在albumin与Aβ的相互作用,其经TSA治疗后随着Aβ减少而减少;（2）免疫荧光染色发现,TSA治疗后的APP/PS1小鼠脑镰血管周围出现albumin与Aβ的大量聚集;（3）与Aβ₄₂组相比,Aβ₄₂+TSA组的bEnd.3细胞中albumin（P<0.001）和Aβ寡聚体（P<0.05）水平明显升高,提示TSA可以显著促进bEnd.3细胞albumin的表达和Aβ寡聚体的内吞。这些结果提示,TSA可以促进albumin与Aβ相互作用形成的复合物向脑镰血管转运,而且还可能通过bEnd.3细胞促进Aβ的外向转运和清除。7.TSA通过增加BV2细胞表达albumin,促进了Aβ吞噬并抑制了Aβ聚集。细胞培养实验结果显示:（1）albumin主要表达在BV2细胞,TSA可促进BV2细胞表达albumin（TSA浓度:60 nM,P<0.05;125 nM,P<0.01;250 nM,P<0.01;TSA处理时间:24 h,P<0.05;36 h,P<0.01）,且该作用可以被TSA特异性抑制剂ITSA-1明显抑制（250 nM,P<0.05;36 h,P<0.01）。（2）albumin处理可明显减少体外孵育的Aβ寡聚体数量（P<0.01）,可以明显促进BV2细胞的迁移（P<0.01）。（3）Aβ₄₂可使BV2细胞变圆,伪足减少、缩短（P<0.05）,经TSA处理后则伪足明显增多、变长（P<0.01）,加入ITSA-1后BV2细胞伪足又明显减少（P<0.01）。APP/PS1+TSA组小鼠海马内也观察到小胶质细胞伪足增多。这提示TSA可激活BV2细胞的吞噬功能。（4）与Aβ₄₂组相比,Aβ₄₂+TSA组的BV2细胞内albumin（P<0.05）和Ac-H4（P<0.001）的表达及Aβ寡聚体含量（P<0.01）明显升高,而ITSA-1可以逆转TSA的作用（P<0.05或P<0.001）,证实了TSA可以促进BV2细胞吞噬Aβ寡聚体。结论:本研究进一步确认了TSA对APP/PS1小鼠学习记忆功能和脑内Aβ病理特征的改善作用,特别是首次发现了TSA可以诱导海马小胶质细胞和脑微血管内皮细胞高表达albumin,继而结合并抑制Aβ聚集,同时TSA促进小胶质细胞和脑微血管内皮细胞吞噬、转运和清除Aβ。