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研究背景肿瘤转移与病人预后不良相关,是肿瘤病人死亡率升高的主要原因。因此肿瘤转移作为治疗目标的重要性不能低估。在转移播散过程中,原发肿瘤的癌细胞可作为单个细胞或多个细胞侵入周围组织,入侵的癌细胞通过血管壁直接内渗（Intravasation）迁移进入血液循环系统。如果它们在剪切应力和血液中的保护性免疫细胞的作用下存活下来,它们最终可以附着在血管的内皮细胞上,在合适的位点循环癌细胞渗出（Extravasation）,然后开始在基质中增殖。肿瘤细胞发生内渗和外渗的过程都需要损坏内皮连接屏障,利于肿瘤细胞穿越内皮细胞,即跨内皮迁移（Trans-endothelial migration,TEM）的过程。形成微小转移的新肿瘤病灶在新的环境中生存和异常增殖,进而形成临床易于检测的大转移肿瘤,因此肿瘤转移的部位可能不仅取决于癌细胞粘附于内皮细胞和渗出的位置,还取决于靶组织中是否存在合适的存活信号。原发肿瘤通过多种机制改变靶器官的血管通透性,使其适于癌细胞的渗出、存活和生长。这种在靶器官中预先改变的微环境,称作转移前微环境（Pre-metastatic niche,PMN）。为了有效治疗转移,因此我们必须抑制基本的转移过程及改变转移前微环境,并制定不依赖原发肿瘤反应的特定临床前和临床策略,探索新的内皮细胞相关治疗靶点及转移前微环境中关键因子是亟待解决的科学问题。研究目的通过TCGA数据库分析乳腺癌和肺腺癌临床数据,鉴定出表达于内皮细胞的与肿瘤转移显著相关的差异基因,通过构建条件性敲除的基因工程小鼠模型验证该基因对肿瘤转移的影响,为抑制肿瘤转移贡献新的靶分子,同时为肿瘤药物评价贡献更优的小鼠模型。研究内容及方法1.基于TCGA里乳腺癌和肺腺癌临床数据差异基因的表达分析。（1）基于TCGA分析在乳腺癌与肺腺癌中表达于血管内皮的差异基因。（2）选取差异基因EMCN分析在原发肿瘤,转移性肿瘤,复发性肿瘤中的表达水平。2.EMCN对内皮细胞增殖及生物学功能的影响。（1）内皮细胞中稳定敲低EMCN的细胞构建。（2）CCK-8检测EMCN对HUVEC增殖的影响,体外检测EMCN影响内皮细胞在Matrigel胶上的成管能力。（3）RNA-seq检测EMCN敲低后内皮细胞生物学功能的改变3.内皮细胞条件性敲除小鼠模型构建及表型分析。（1）利用Cre-Loxp系统构建特异性敲除内皮细胞EMCN小鼠模型,PCR鉴定小鼠基因型,Western blot检测蛋白敲除效率。（2）将内皮细胞条件性敲除EMCN小鼠与C57BL/6小鼠的肺,肝,脾,肾等进行病理学检测,对小鼠表型分析。4.内皮细胞条件性敲除小鼠模型体内抑制肿瘤生长和转移的研究。（1）内皮细胞特异性敲除小鼠模型皮下肿瘤生长的研究。（2）内皮细胞特异性敲除小鼠模型尾静脉肺转移的研究。（3）内皮细胞特异性敲除小鼠模型皮下肿瘤手术切除后肺转移的研究。5.EMCN基因敲除小鼠肺转移的分子机制研究。（1）RNA-seq揭示WT和EMCNecko小鼠肺部微环境的改变。（2）EMCN基因敲除小鼠肺部转移前微环境中血管通透性,中性粒细胞及相关因子的检测。6.Notch抑制剂联合Anti-TGF-β对体内肿瘤生长和转移的影响及临床意义。（1）Western blot检测Notch与EMCN蛋白表达确定其调控关系。（2）Notch抑制剂与Anti-TGF-β抗体联合处理小鼠评价对皮下肿瘤体内生长和转移的影响。（3）基于TCGA数据分析Notch与EMCN的表达水平对肿瘤患者生存率的影响。研究结果TCGA临床数据分析结果表明,在肺腺癌和乳腺癌中,肿瘤内EMCN的mRNA水平显著低于正常组织,在转移和复发的肿瘤病人中,EMCN的mRNA水平显著下降。内皮细胞中稳定敲低EMCN后结果显示,EMCN敲低显著抑制体外内皮细胞的增殖和血管形成。RNA-seq检测EMCN主要影响内皮细胞间的连接。Western blot检测肺,肝,脾,肾中的EMCN蛋白表达显示内皮细胞条件性敲除小鼠模型构建成功,对肺,肝,脾,肾进行HE染色显示EMCN的敲除对组织结构无明显影响。我们发现内皮细胞特异性敲除小鼠模型对于皮下肿瘤生长没有明显影响,但是显著促进了肿瘤肺转移能力。RNA-seq,Western blot,免疫组织化学揭示内皮细胞特异性敲除EMCN小鼠模型肺部转移前微环境中MMP9,S100A8/A9,TGF-β等蛋白显著上调。EMCN的敲除显著促进了肺部中性粒细胞的浸润,进一步分析发现TGF-β促进了中性粒细胞的极化进而促进肿瘤的转移。抗TGF-β抗体治疗确实有效地消除了 TGF-β诱导的中性粒细胞极化,从而减少了肿瘤的肺转移。Notch作为EMCN的上游调节分子,抑制Notch可上调EMCN的表达,显著抑制体内肿瘤的生长和转移,延长小鼠生存期。值得注意的是,Notch抑制剂和抗TGF-β抗体的联合应用可有效抑制肿瘤生长和肺转移。结论1.本研究将内皮细胞特异性敲除EMCN小鼠模型构建成功,并通过该模型首次观察到EMCN的体内敲除对于肿瘤生长没有明显影响而是促进肿瘤转移。2.内皮细胞特异性敲除EMCN小鼠引起肺部转移前微环境的改变,关键因子TGF-β促进中性粒细胞发生极化进而促进肿瘤转移。3.EMCN敲除引起肿瘤转移的结果提示,通过Notch抑制剂联合Anti-TGF-β能够抑制肿瘤的生长和转移,并可能为临床肿瘤转移患者提供一种预防和治疗策略。