研究背景乳腺癌(Breast cancer, BC)发病率高居女性恶性肿瘤首位,严重威胁女性身心健康。世界卫生组织(WHO)在《全球癌症报告2014》中发布数据：2012年全球新增病例位居前列的三大癌症为肺癌、乳腺癌、大肠癌；乳腺癌新增167.7万人,中国为18.7万人。中国肿瘤登记年报数据显示,2012年我国女性乳腺癌发病率达42.55/10万。研究表明我国乳腺癌标化患病率为207.7/10万,近3年病例占10年内病例总数的67.55%。我国乳腺癌发病率呈现快速上升的趋势。随着对乳腺癌发病机制及其伴发疾病流行病学研究的不断深入,人们逐渐认识到,乳腺癌患者中,肥胖、中心性肥胖患者的比例明显较高。我们推测肥胖及其相关因素在乳腺癌发病过程中发挥了一定作用。近年来我国女性肥胖率持续上升,国内外对肥胖、中心性肥胖的定义有所差别。目前研究结果也并非一致性指向二者与乳腺癌密切相关,因此,肥胖、中心性肥胖及其相关检测指标与我国女性乳腺癌的关系仍需要进一步研究。目前研究表明,肥胖是一种系统性炎性疾病,脂肪组织不仅是一个储存脂肪的场所,也具备重要的内分泌功能。在肥胖与恶性肿瘤的相关研究中,脂肪因子是二者分子水平的纽带。越来越多的研究结果显示,脂联素可能是肥胖致癌的关键因素之一,与乳腺癌发病风险间存在一定关系,并通过多种途径发挥抑癌作用。鉴于肥胖与乳腺癌的相关性,对脂联素进行深入研究十分必要。脂联素基因定位的区域存在代谢综合征、2型糖尿病及冠心病的易感位点,因此近年来该基因及其表达产物受到广泛关注。脂联素具有胰岛素增敏、抗动脉粥样硬化、调节糖脂代谢、抗增殖、诱导凋亡、抗血管生成等作用,与胰岛素抵抗、代谢综合征、肥胖及恶性肿瘤的发生密切相关。Miyoshi Y等首先报道了脂联素与乳腺癌的关系,认为低脂联素水平可增加乳腺癌发病风险。随后众多学者针对脂联素与乳腺癌风险进行了大量病例对照研究,并未得出一致性结论。通过比较相关文献,我们认为造成基础研究成果与病例对照研究结果不一致的原因在于：①人体血浆中脂联素并非单一成分,各组分在生物学活性、受体亲和力等方面存在差异。以乳腺癌病例对照样本为基础的研究中,检测的目的蛋白多为血清／血浆空腹血脂联素水平,即几乎包括各种脂联素形态在内的总脂联素水平；②以乳腺癌细胞株、实验动物研究为基础的体内、体外实验中,干预蛋白多为纯化形式的脂联素,并不完全模拟体内真实情况,其实验结果也就不能反映人体内真实情况；③不同人种血浆脂联素水平存在一定差异,国外实验数据不一定符合我国人口特征；④乳腺癌病例对照研究纳入样本量参差不齐,造成了一定的数据偏倚。同总脂联素相比,高分子量(high-molecular-weight, HMW)旨联素在胰岛素敏感性、炎症、心脏病、恶性肿瘤等方面的研究中均具有一定的特殊性：①同总脂联素相比,HMW旨联素与餐后血糖浓度关系更为密切；②口服噻唑烷二酮后,HMW/,总脂联素比值的改变与改善胰岛素敏感性相关,而总脂联素水平无此现象；③LMW脂联素具有抗炎作用,而HMW与促炎有关；④同LMW脂联素相比,HMW脂联素与心脏疾病关系更为密切；⑤血清中非HMW脂联素比例升高是导致慢性丙肝患者发展为肝细胞肝癌的原因；⑥低HMW脂联素水平是绝经后乳腺癌的独立危险因素。由此我们推测,血浆脂联素水平与乳腺癌风险研究结果不甚一致的原因之一在于：同总脂联素相比,血浆HMW旨联素绝对值或HMW/,总脂联素比值可能是影响乳腺癌风险的分子水平真实因素。本研究拟通过基于人群的流行病学研究、基于医院的病例对照研究,评价：①肥胖、中心性肥胖与乳腺癌的相关性；②血浆总脂联素、HMW脂联素、HMW/总脂联素比例与乳腺癌风险的关系,探讨我国女性血浆总脂联素、HMW脂联素、HMW/总脂联素比例的危险值。通过以上研究,可以为丰富基于我国女性基础数据建立的乳腺癌高危人群筛选模型、提高其灵敏度及特异度提供分子流行病学基础；为针对特定脂联素组分的乳腺癌预防措施的研究提供基础。研究目的乳腺癌是我国女性发病率最高的恶性肿瘤,严重影响女性身心健康,社会负担及经济负担巨大。影响乳腺癌发病的相关因素可分为可控因素(体育锻炼、吸烟、不合理饮食、肥胖、中心性肥胖等)与非可控因素(性别、乳腺癌家族史、初潮年龄等)。肥胖、中心性肥胖作为可控因素,其与我国女性乳腺癌的相关性仍需进一步明确。近年来我国女性肥胖率持续上升,其相关检测指标与我国女性乳腺癌的关系仍需要进一步研究。因此本研究拟通过卫生部(原)属(管)临床学科重点项目“乳腺癌高危人群筛选模型建立及化学预防干预的研究”的数据,在我国三省一市实施乳腺癌现状横断面流行病学调查,以获取乳腺癌流行病学特征,进一步明确肥胖等因素与乳腺癌发病风险的相关性。问卷调查中涵盖多项肥胖相关指标,通过1：3配对的病例对照研究资料,进一步分析肥胖及其相关指标与我国女性乳腺癌的关系,为相关预防控制措施及肥胖相关分子流行病学指标的研究提供科学依据。研究方法1.研究对象的选择本部分研究内容依托2008年度国家卫生部(原)属(管)医院临床学科重点项目一“乳腺癌高危人群筛选模型的建立与化学干预的研究”(编号：07090122)。项目实施前,相关实施方案等已经通过山东大学第二医院伦理委员会审核并批准实施。该课题由山东大学第二医院牵头,经由山东大学第二医院、河北医科大学第四医院、天津市肿瘤医院、江苏省肿瘤医院、山东大学公共卫生学院协调实施。研究对象覆盖山东省、河北省、江苏省、天津市。采用整群随机抽样的方法,在上述三省一市中选取抽样调查点。2.流行病学调查实施方案本项目实施前,综合汇总乳腺外科、卫生统计学、流行病学、医学心理学、营养与食品卫生学等相关专业知识并经由多名专家沟通后,综合考虑调查可实施性及后期统计学分析要求等,形成调查所用问卷。调查时间为：2008年07-09月。调查内容主要包括两方面,即：由经培训的调查员主导的面对面访谈、由乳腺专科医生主导的临床乳腺检查。每份问卷内容涵盖基本信息、疾病与家族史、生活习惯、服药及使用化学试剂史、其他、临床及辅助检查六部分。每份问卷均具有唯一编码。对收集的所有问卷进行认真核对、复查,使用数据管理软件Epidata3.1建立数据库,所有问卷均采用双录入,并对资料进行逻辑检查和处理。3.配对(1：3)病例对照研究研究对象的选择以横断面调查过程中发现的2年内乳腺癌患者为病例,按照1：3匹配的原则选择离病例最近的邻居中的无血缘关系、可匹配的、查体确认健康的人群为对照,匹配因素为同年龄组(±2岁)、同地区、最近的邻居(或同事),病例和对照均为当地居住满2年以上的居民。病例和对照的选择条件严格按照项目研究设计的标准执行。4.统计学分析将Epidata中的数据以SPSS输出格式导出。资料整理和分析均采用SPSS22.0、 Epidata3.1软件。Excel一般特征描述方面,用构成比描述病例组与对照组研究对象的主要特征,计数资料采用n(%)表示,计量资料采用均数±标准差表示。采用(Mean±SD)方差齐性检验,对连续性资料的方差进行检验。采用单因素条件Levene回归分析筛选影响因素,取α=0.05,计算其比值比Logistic及95%可信(odds ratio, OR)区间对纳入多因素分析的变量采用后退法进行多因(confidence interval, CI)。素条件回归分析,按a=0.05显著性水平对参数进行似然比检验,并分别Logistic计算具有显著性意义变量的OR值及其95%CI。结果1.横断面流行病学调查相关结果1.1描述性结果122,058例研究对象的平均年龄为44.2(±11.6)岁。乳腺癌患者的平均年龄为47.8(±9.3)岁。绝经、乳腺良性肿瘤史、糖尿病、乳腺癌一级家族史、乳腺癌二级家族史、超重及肥胖、中心性肥胖等与乳腺癌风险有关(P均<0.05)。初潮年龄、乳腺癌三级家族史、身高、腰臀比、首次足月妊娠年龄等与乳腺癌风险无关(P>0.05)(见第一部分表1)。1。2乳腺癌相关因素单因素Logistic回归分析结果将乳腺癌相关因素与乳腺癌风险相关性进行单因素Logistic回归分析。肥胖、中心性肥胖、乳腺癌一级家族史、乳腺癌二级家族史、绝经、乳腺良性肿瘤史为乳腺癌危险因素(P均<0.05)。初潮年龄、乳腺癌三级家族史与乳腺癌风险无关(P>0.05)(见第一部分表2)。1.3乳腺癌相关因素多因素Logistic回归分析结果因肥胖、中心性肥胖有一定的相关性,不同时纳入多因素分析。首先纳入肥胖、乳腺癌一级家族史、乳腺癌二级家族史、绝经状态、乳腺良性肿瘤史(单因素Logistic回归分析中P<0.05者)进行多因素条件Logistic回归分析。结果显示：肥胖、乳腺癌一级家族史、乳腺癌二级家族史、绝经、乳腺良性肿瘤史阳性均为乳腺癌危险因素,其中肥胖相关OR=2.183,95%CI：1.631-2.921(详见第一部分表3)。将上述纳入多因素分析的因素中的肥胖更换为中心性肥胖,其他因素及分析方法不变。结果显示：中心性肥胖、乳腺癌一级家族史、乳腺癌二级家族史、绝经、乳腺良性肿瘤史为乳腺癌危险因素,其中中心性肥胖相关OR=2.045,95%CI：1.614-2.592(详见第一部分表4)。2.配对(1：3)病例对照研究的相关结果2.1配对(1：3)病例对照研究描述性结果492例研究对象的平均年龄为49.94(±9.44)岁,病例组的平均年龄为49.95(±9.48)岁；对照组的平均年龄为49.92(±9.37)岁。中心性肥胖、肥胖、乳腺良性肿瘤史、乳腺癌一级家族史等与乳腺癌风险相关(P<0.05)；初潮年龄、绝经、乳腺癌二级家族史、身高、糖尿病等与乳腺癌风险无关(P>0.05)(见第一部分表5)。2.2配对(1：3)病例对照研究的相关指标单因素Logistic回归分析结果将乳腺癌相关因素与乳腺癌风险相关性进行单因素Logistic回归分析。肥胖、中心性肥胖、乳腺良性肿瘤史、乳腺癌一级家族史均为乳腺癌危险因素(P均<0.05)；初潮年龄、糖尿病、绝经及乳腺癌二级家族史与乳腺癌风险无关(P>0.05)(详见第一部分附表6)。2。3配对(1：3)病例对照研究的相关指标多因素Logistic回归分析结果因肥胖、中心性肥胖有一定的相关性,不同时纳入多因素分析。首先纳入肥胖、乳腺癌一级家族史、乳腺良性肿瘤史(单因素Logistic回归分析中P<0.05者)进行多因素条件Logistic回归分析。肥胖、乳腺癌一级家族史、乳腺良性肿瘤史为乳腺癌危险因素,其中肥胖相关OR=2.476,95%CI:1.410-4.347(详见附表7)。将上述纳入多因素分析的因素中的肥胖更换为中心性肥胖,其他因素及分析方法不变。中心性肥胖、乳腺癌一级家族史、乳腺良性肿瘤史为乳腺癌危险因素,其中中心性肥胖相关OR=1.631,95%CI:1.053-2.524(详见附表8)。结论肥胖(BMI≥28.0kg/m2)、中心性肥胖(腰围≥85cm)均与我国女性乳腺癌发病风险有关,是乳腺癌的危险因素。肥胖相关因子的研究可能会为我国女性乳腺癌高危人群筛选模型的分子流行病学指标提供参考。研究目的前期研究结果证实,肥胖、中心性肥胖与乳腺癌的发生有明显相关性,作为肥胖相关重要因素的脂肪因子是否是连接肥胖与乳腺癌的桥梁仍需进一步明确,其可能是肥胖相关因素影响乳腺癌风险的分子水平真实因素。脂联素作为一种脂肪因子,可促进脂肪细胞的分化,且具有抗血管生成及抗增殖活性,是肥胖致癌的关键因子之一。人外周血中脂联素非单一成分,目前基于动物、细胞、人体组织来源的大多数实验的检测指标为总脂联素或脂联素；细胞、动物实验中给予的外源性脂联素也均为单一成分,并不能完全反映人体内的真实情况。人体外周血来源的流行病学研究结论也并不一致,脂联素与乳腺癌的相关性仍不十分明确。这与基础实验的结论并不一致。通过比较相关文献,我们认为造成基础研究成果与实际病例对照研究结果不一致的原因可能在于：①人体血浆中脂联素并非单一成分,HMW脂联素在生物学活性、受体亲和力等方面与其他成分有一定差异,而以乳腺癌病例对照资料为主体的研究中目的蛋白多为总脂联素；②基础实验中干预蛋白多为纯化形式的脂联素,并不完全模拟体内真实情况,实验结果不能反映体内真实情况；③不同人种血浆脂联素水平存在一定差异,国外实验数据不一定适于我国人口特征；④乳腺癌病例对照研究纳入样本量参差不齐,造成一定的数据偏倚。因此,我们认为,有必要从血液中脂联素不同组分入手,探讨血浆中脂联素组分与乳腺癌发病风险的关系,明确与乳腺癌风险真实有关的脂联素指标,为进一步研究脂联素与乳腺癌发生发展的关系及脂联素相关行为干预对乳腺癌的预防提供理论基础。研究方法1.研究对象资料收集及处理第二部分的研究依托2010年度卫生部(原)属(管)临床重点学科重点项目“乳腺癌高危人群筛选及评估体系的建立与完善”及2014年度山东省自然科学基金重点项目“血浆高分子量脂联素及相关单核苷酸多态性与乳腺癌发病风险的评估”(ZR2014HZ004)。本项目实施前,已通过山东大学第二医院伦理委员会审核并批准。病例组：本研究选择2012年4月到2013年4月期间在山东大学第二医院等21家三级甲等医院住院治疗、常规病理诊断确诊的新发乳腺癌患者为病例组研究对象。对照组：选择同期就诊于同一家医院的查体中心健康女性、住院诊疗的非乳腺癌患者为对照组的来源。采用面对面访谈式问卷调查获得基础问卷资料；常规病理及相关辅助检查资料经研究对象同意后摘录自相应医疗文书,主要为病历、查体报告等。每一例研究对象均有唯一的问卷编码。主要包括基础问卷、乳腺临床检查表、其它体格检查表、乳腺癌患者生命质量测定量表FACT-B(V4.0)。本研究采用1：1配对的病例对照研究,配对条件为：年龄±3岁；就诊于同一家医院；汉族；就诊时间±2个月。在研究对象接受任何形式的局部、全身治疗前,在研究对象知情同意的基础上,以静脉穿刺针取空腹静脉全血4m1置于血常规试管,处理后冻存备用。对所有问卷资料进行整理,严格审核病例组、对照组纳入、排除标准及配对因素。剔除不符合要求的配对资料。所有资料采用Epidata系统进行录入,背靠背双录入方式复核数据。录入完毕后,将Epidata数据导入SPSS22.0。2.酶联免疫吸附法(EL ISA)检测血浆总脂联素、HMW脂联素水平采用人外周血总脂联素检测试剂盒、人外周血HMW脂联素检测试剂盒(美国R&D公司)对1167对病例对照研究对象血浆中总脂联素、HMW脂联素水平进行检测。实验操作步骤严格按照试剂盒说明书进行。将所得数据录入SPSS数据库,并计算HMW/,总脂联素比例。3.统计学分析方法采用SPSS22.0对所有数据进行统计分析。在1167对病例对照研究的统计分析中,对于连续数值变量采用配对t检验,以均数±标准差(Mean±SD)、t值表示；若变量不符合正态性分布,则以中位数±IQR (Median±IQR)表示；对于分类变量采用Chi-square检验,以n(%)、χ2表示；将乳腺癌相关因素进行单因素Logistic回归分析；行RO C曲线分析,根据约登指数最大值法确定最佳截点值,并以此为界将相应指标变为二分类变量,并将赋值后的指标进行单因素Logistic回归分析；将P<0.05者纳入多因素条件Logistic回归分析。将1167对基于医院的病例对照研究资料按照亚组进行分层。分层指标分别为：绝经前、绝经后、有乳腺癌家族史、无乳腺癌家族史、BMI<24.0kg/m2、 BMI≥24.0kg/m2、中心性肥胖、非中心性肥胖等分别进行亚组分析,每个亚组均不再采用原有配对情况,即变为非配对的病例对照研究资料。具体分析方法与之前类似,即对于连续数值变量采用非配对t检验,对于分类变量采用Chi-square检验,根据ROC曲线及约登指数等结果决定脂联素相关指标的截点值,行二分类后的单因素Logistic回归分析,并根据具体情况判断是否行多因素Logistic回归分析。结果1.1167对病例对照研究的描述性结果病例组的平均年龄为47.65(±8.65)岁；对照组的平均年龄为46.71(±8.77)岁。病例组和对照组在BMI、是否绝经、中心性肥胖、乳腺癌家族史因素存在统计学差异(P<0.05)；两组间在平均生育次数、首次生育年龄、孩子个数、身高、初潮年龄、糖尿病方面无明显统计学差异(P>0.05)(详见附表2-1)。2.1167对病例对照研究脂联素相关指标结果本部分结果均采用配对资料t检验进行统计学分析。在整体样本中,病例组血浆总脂联素浓度平均值为6.34 (±3.54)μg/ml,对照组血浆总脂联素浓度平均值为6.56(±3.72)μg/ml, P=0.150;病例组HMW脂联素平均水平为2.52(4-1.88)μg/ml,对照组HMW脂联素平均水平为2.58 (±1.88)μg/ml, P=0.403; HMW/总脂联素比例,病例组、对照组平均值均为0.38(±0.15),P=0,590。作为连续数值变量,总脂联素、HMW旨联素、HMW/总脂联素比例三者,在病例组与对照组间,均无统计学差异(详见附表2-2)。3.1167对病例对照研究的Logistic回归分析结果以ROC曲线分析1167对整体资料中血浆脂联素组分情况,得出每个总脂联素、HMW脂联素、HMW/总脂联素比例的具体数值相对应的灵敏度及特异度,以约登指数最大值所对应的原始数值为截点值(cut-off值),将三个指标变为二分类资料。单因素Logistic回归分析各相关因素(绝经、BMI、糖尿病、乳腺癌家族史、初潮年龄、总脂联素、HMW脂联素、HMW/,总脂联素比例等)与乳腺癌的相关性。结果显示：绝经、肥胖、乳腺癌家族史、中心性肥胖是乳腺癌的危险因素；HMW脂联素高于1.421-tg/ml是乳腺癌的保护因素,P=0.042, OR=0.835,95%CI为0.701-0.993；糖尿病、初潮年龄早、总脂联素水平高、HMW/总脂联素比例高与乳腺癌风险间无明显相关性。单因素Logistic回归分析结果提示,HMW脂联素表达高低与BMI超标有相关性(P<0.001),与中心性肥胖无明显相关性(P=0.281)。将单因素Logistic回归中P值小于0.05者(不含BMI)纳入多因素分析结果提示,HMW脂联素高于1.42μg/ml是乳腺癌的保护因素,P=0.048,OR=0.828,95%CI为0.687-0.998(详见第二部分附表2-3)。4.亚组分析结果将整体样本,按照绝经前、绝经后、乳腺癌家族史阳性、乳腺癌家族史阴性、BMI正常、BMI超标、中心性肥胖、非中心性肥胖进行分层,分别进行血浆不同脂联素组分与乳腺癌风险的相关统计学分析。具体结果如下：BMI超标、中心性肥胖、乳腺癌家族史是绝经前乳腺癌的危险因素：糖尿病、初潮年龄早、总脂联素水平升高、HMW脂联素高、HMW/总脂联素比例高与绝经前女性乳腺癌风险间无明显相关性(详见附表2-4)。HMW脂联素高、HMW/,总脂联素比例高是绝经后乳腺癌的保护因素；中心性肥胖、BMI、糖尿病、初潮年龄早、乳腺癌家族史阳性、总脂联素水平高与绝经后女性乳腺癌风险间无明显相关性(详见附表2-5)。HMW脂联素高、总脂联素比例高是有乳腺癌家族史亚组的危险因素；中心性肥胖、绝经、BMI、糖尿病、初潮年龄早、HMW/总脂联素比例高与乳腺癌家族史阳性女性的乳腺癌风险间无明显相关性(详见附表2-6)。绝经、中心性肥胖、BMI超标、是乳腺癌家族史阴性女性乳腺癌的危险因素；HMW脂联素高是乳腺癌家族史阴性亚组的保护因素；糖尿病、初潮年龄早、总脂联素水平高、HMW/总脂联素比例高与乳腺癌家族史阴性女性的乳腺癌风险间无明显相关性(详见附表2-7)。将单因素Logistic回归中P值小于0.05者纳入多因素分析,结果提示,HMW脂联素高于1.42gg/ml是乳腺癌相关保护因素,P=0.013,OR=0.785,95%CI为0.649-0.951(详见第二部分附表2-7)。绝经后、乳腺癌家族史是BMI正常女性乳腺癌的危险因素；总脂联素高是BMI正常女性乳腺癌的保护因素；中心性肥胖、糖尿病、初潮年龄早、HMW脂联素水平高、HMW/总脂联素比例高与BMI正常女性乳腺癌风险间无明显相关性(详见附表2-8)。将单因素Logistic回归分析中P值小于0.05者纳入多因素分析,结果提示,总脂联素高于12.52μg/ml不是独立于绝经状态的乳腺癌相关保护因素,P=0.096。HMW脂联素高是BMI≥24.0kg/m2女性乳腺癌的保护因素；中心性肥胖是本亚组女性乳腺癌危险因素；绝经后、糖尿病、乳腺癌家族史阳性、初潮年龄早、总脂联素水平高、HMW/,总脂联素比例高与BMI≥24.0kg/m2女性的乳腺癌风险间无明显相关性(详见附表2-9)。单因素Logistic回归分析中p值小于0.05者纳入多因素分析,结果提示,HMW脂联素不是本亚组乳腺癌相关保护因素,P=0.060。BMI>24.0kg/m2,绝经、糖尿病、乳腺癌家族史阳性、初潮年龄早、总脂联素水平高、HMW/总脂联素比例高与中心性肥胖亚组女性的乳腺癌风险间均无明显相关性(详见附表2-10)。乳腺癌家族史为非中心性肥胖亚组乳腺癌危险因素；绝经为非中心性肥胖亚组的乳腺癌保护因素。BMI、糖尿病、初潮年龄早、总脂联素水平高、HMW/总脂联素比例高与本亚组女性的乳腺癌危险性间均无明显相关性(详见附表2-11)。结论血浆中不同形式的脂联素组分可能在乳腺癌风险中作用不同。1.血浆HMW脂联素水平高(>1.42μg/ml)是乳腺癌的保护因素。2.对于有乳腺癌家族史的汉族中国女性而言,血浆HMW脂联素高与其他亚组相关结果并不一致,是乳腺癌的危险因素。