论文部分内容阅读
木聚糖酶（xylanases,EC 3.2.1.8）是内切β-1,4-D-木聚糖酶的简称,能够水解木聚糖分子主链内部的β-1,4-D-木糖苷键,广泛应用于纺织、食品、造纸、饲料工业以及功能性低聚木糖和燃料乙醇的生产等领域。由于木聚糖酶在应用过程中经常遇到高温环境,具有高热稳定性的木聚糖酶具有更大的应用潜力和发展前景。作者所在实验室前期从米曲霉（Aspergillus oryzae）基因组中克隆了一种糖苷水解酶（GH）11家族木聚糖酶基因Aoxyn11A,并成功将其在毕赤酵母（Pichia pastoris）GS115中进行了表达。除温度特性较差外,木聚糖酶Ao Xyn11A具有较高的催化活性和优良的酶学特性。本论文以Ao Xyn11A为研究对象,通过迭代突变技术对编码该酶的基因Aoxyn11A进行改造,以期获得温度特性改善的突变酶;然后将具有较高热稳定性的突变酶应用到合欢皮总皂苷的提取工艺中,建立最优工艺条件,提高总皂苷收率。基于Ao Xyn11A三维结构的同源建模、分子动力学模拟及其与7种同一家族耐热木聚糖酶的多序列比对,对具有较高B-factor值且序列上不保守的两个氨基酸Gly21和Ile127实施迭代饱和突变。以重组表达质粒p ET-28a-Aoxyn11A为模板,采用全质粒PCR技术对Aoxyn11A中编码Gly21的密码子实施饱和突变,将连有突变酶基因的质粒p ET-28a-Aoxyn11AG21X转入E.coli BL21（DE3）感受态细胞,构建了突变文库。以酶的热稳定性为指标,从文库中筛选出最优突变转化子(E.coli/Aoxyn11AG21I)。DNA测序结果显示,E.coli/Aoxyn11AG21I表达一种由Ile替换了Gly21的突变酶Ao Xyn11AG21I。然后对Ao Xyn11AG21I中编码Ile127的密码子实施饱和突变,构建突变文库并筛选,结果显示,获得的所有突变酶Ao Xyn11AG21I-I127X的温度特性较Ao Xyn11A和Ao Xyn11AG21I均有所降低,说明Ile127突变对Ao Xyn11A的热稳定性起到了负效果。基于Ao Xyn11A与同一家族7种耐热木聚糖酶一级结构的多序列同源比对及其三维结构的同源建模和分子动力学模拟,设计了突变酶Ao Xyn11AY13F和Ao Xyn11AG21I-Y13F。采用全质粒PCR技术分别将Aoxyn11A和Aoxyn11AG21I中编码Tyr13的密码子TAC突变为Phe的TTC,获得了突变酶基因Aoxyn11AY13F和Aoxyn11AG21I-Y13F。分别将基因Aoxyn11AG21I、Aoxyn11AY13F和Aoxyn11AG21I-Y13F在P.pastoris GS115中实施了表达,并对重组表达产物Ao Xyn11AG21I、Ao Xyn11AY13F和Ao Xyn11AG21I-Y13F的酶学性质进行了分析。Ao Xyn11AG21I-Y13F的最适温度(Topt)为60℃,较Ao Xyn11AG21I和Ao Xyn11AY13F均提高了5℃,较Ao Xyn11A提高了10℃;另外,Ao Xyn11AG21I-Y13F在50℃下的半衰期(t501/2)约为240 min,分别是Ao Xyn11A、Ao Xyn11AG21I和Ao Xyn11AY13F的40、3.4和2.5倍;Ao Xyn11A、Ao Xyn11AG21I、Ao Xyn11AY13F和Ao Xyn11AG21I-Y13F的熔解温度（Tm值）分别为52.3、56.5、58.6和61.3℃。以上结果表明突变点Gly21Ile和Tyr13Phe对Ao Xyn11A温度特性的提高具有协同作用。另外,Ao Xyn11AG21I-Y13F的催化效率(kcat/Km)为473.1 m L·mg-1·s-1,较Ao Xyn11A的提高了1.65倍。将突变酶Ao Xyn11AG21I-Y13F应用到合欢皮总皂苷的提取工艺,以总皂苷收率为考核指标,确定了最佳工艺条件:酶解温度45℃、酶用量150 U·g-1、酶解时间8 h、固液比1:25（g:m L）。在此工艺条件下,木聚糖酶解辅助乙醇回流法提取获得的总皂苷收率较木聚糖酶解法和乙醇回流法所获得的分别提高了17.55%和14.66%。