【摘 要】
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目的:本研究旨在探究7-脱氢胆固醇还原酶（7-dehydrocholesterolΔ7-reductase,DHCR7）在上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer,EOC）细胞系SKOV3中的表达及其作用机制,研究诱导DHCR7表达在体外抑制上皮性卵巢癌细胞SKOV3增殖作用的有效性,初步探讨DHCR7抑制剂AY 9944对卵巢癌细胞生长、迁移抑制和顺铂敏感性方面的影响及作
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目的:本研究旨在探究7-脱氢胆固醇还原酶（7-dehydrocholesterolΔ7-reductase,DHCR7）在上皮性卵巢癌（Epithelial Ovarian Cancer,EOC）细胞系SKOV3中的表达及其作用机制,研究诱导DHCR7表达在体外抑制上皮性卵巢癌细胞SKOV3增殖作用的有效性,初步探讨DHCR7抑制剂AY 9944对卵巢癌细胞生长、迁移抑制和顺铂敏感性方面的影响及作用机制,为临床难治性卵巢癌患者的治疗方案的开发提供一定的实验和理论依据。方法:1.首先应用实时定量PCR技术比较胆固醇代谢相关基因在正常人卵巢上皮细胞株IOSE80和卵巢癌细胞株OVCAR3、SKOV3的表达差异,评估其胆固醇合成转运等相关基因的表达差异,选择DHCR7进一步探究,利用7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂AY 9944作用于SKOV3细胞,经筛选后选择最佳浓度和作用时间,提取细胞总RNA,应用实时定量PCR技术检测AY 9944是否诱导增加DHCR7基因的表达水平。2.运用 CCK-8（Cell Counting Kit-8）检测不同浓度 AY 9944 作用于 SKOV3 细胞12小时、24小时、48小时对细胞活性的影响。再取适当浓度作用于SKOV3适当时间后提取细胞总蛋白和细胞总RNA,利用Western-blot技术研究PI3K、AKT和磷酸化AKT——p-AKT的蛋白表达变化,同时使用Q-PCR技术检测PIK3CB、CCND1、CASP3等基因mRNA表达水平变化,以此探究AY9944诱导SKOV3细胞中DHCR7基因表达导致细胞变化的分子机制。3.通过细胞划痕实验观察适当浓度AY 9944对SKOV3细胞迁移能力的影响,分别于0小时、24小时、48小时用倒置显微镜拍照记录对照组和AY 9944加药组的划痕愈合情况,Image J测量并统计分析,AY9944是否抑制SKOV3细胞的迁移。4.通过CCK-8检测适当浓度的AY9944和不同浓度的顺铂（Cisplatin）联合应用是否影响SKOV3细胞对顺铂的敏感性,以此探究DHCR7基因在卵巢癌化疗耐药方面的作用。结果:1.和正常卵巢上皮细胞IOSE80相比,OVCAR3表现为大部分胆固醇合成、转运相关酶基因表达的降低,SKOV3则大部分表现为表达升高;而编码7-脱氢胆固醇还原酶的基因DHCR7在两者均表现为明显下调;用DHCR7抑制剂AY 9944处理细胞,能够诱导DHCR7基因表达上调。2.在SKOV3细胞中,利用AY9944诱导DHCR7表达抑制细胞增殖;与对照组相比,SKOV3细胞中DHCR7表达上调后AKT蛋白水平无明显变化,PI3K、p-AKT蛋白水平降低;PIK3CB、CCND1 mRNA表达水平降低,CASP3mRNA表达无显著变化。3.AY 9944使SKOV3细胞迁移能力降低。4.CCND1在A2780的顺铂耐药细胞系中显著上调,AY9944未增加SKOV3细胞对顺铂的敏感性。结论:1.AY 9944作为7-脱氢胆固醇还原酶抑制剂能够诱导DHCR7表达。2.在SKOV3中,DHCR7表达上调抑制细胞增殖、降低细胞迁移能力;AY9944能够抑制PI3K/AKT通路,下调CCND1基因的表达。3.AY9944未能改善SKOV3细胞的顺铂耐药。
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