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脑胶质细胞瘤是颅内常见的原发肿瘤,预后不良。尽管采取了手术、放疗和化疗等综合治疗措施,仍然难以取得满意的疗效。RUNX3基因是人类Runt结构域转录因子家族成员,在神经轴突形成、细胞增殖和凋亡等方面发挥重要的作用。最近的研究表明RUNX3基因在多种肿瘤中表达下调,是一候选抑瘤基因,其表达的调控多与基因启动子甲基化状态有关。但目前关于RUNX3基因在胶质瘤中的表达特点还不清楚,其在胶质瘤中的表达调控机制有待进一步研究。本研究运用免疫组化检测RUNX3蛋白在胶质瘤和正常脑组织中的表达,分析其表达与各临床资料的关系;随后运用MSP检测胶质瘤中RUNX3基因启动子甲基化的状态,初步探讨其在胶质瘤中表达下调的分子机制;最后运用特异性去甲基化药物5-氮胞苷干预胶质瘤细胞株,试图通过逆转甲基化状态恢复RUNX3基因的表达,并检测胶质瘤细胞的增殖和侵袭能力,观察5-氮胞苷对胶质瘤细胞株的影响。第一章RUNX3蛋白在胶质瘤中的表达及临床意义目的:研究RUNX3蛋白在正常脑组织和胶质瘤中表达,探索RUNX3基因在胶质瘤中的作用,以及RUNX3蛋白在胶质瘤中异常表达与临床病理资料之间的关系。方法:运用免疫组化的方法检验了40例脑胶质瘤和8例正常脑组织石蜡标本中RUNX3蛋白的表达情况,并比较RUNX3蛋白在各临床病理特征分组间的差异。结果:正常脑组织中RUNX3蛋白均为阳性或强阳性表达,而在17/4.0（42.5%）胶质瘤中为阴性或弱阳性表达,其表达水平在胶质瘤中较正常脑组织中明显下降（P=0.024）。RUNX3蛋白在胶质瘤中的表达随着肿瘤恶性程度的增加表达进行性降低（r=-0.478,P=0.002）,低级别（Ⅰ-Ⅱ级）胶质瘤中IRS为7.70±3.20,高级别（Ⅲ-Ⅳ级）胶质瘤中IRS为4.75±2.88,RUNX3蛋白在低级别和高级别胶质瘤中表达强度有明显差异（X2=8.697,P=0.020）。但RUNX3蛋白的表达与胶质瘤的病理类型、患者年龄、性别、肿瘤部位等因素无显著相关性。结论:RUNX3蛋白在胶质瘤组织中存在明显的表达缺失或下调,并且其表达水平随着肿瘤级别的升高而降低。RUNX3基因可能作为一抑瘤基因参与了胶质瘤的发生和发展。第二章胶质瘤中RUNX3基因的转录表达及其启动子甲基化状态的研究目的:检测RUNX3基因启动子甲基化情况,探索影响RUNX3基因在胶质瘤和正常脑组织中表达差异的分子机制。方法:分别运用RT-PCR和Western blot方法检测10例正常脑组织和35例胶质瘤新鲜标本中RUNX3 mRNA和蛋白的表达水平,分析其与临床病理资料之间的关系,运用特异性甲基化PCR（MSP）检测同批标本的RUNX3基因启动子甲基化情况,分析RUNX3基因表达水平与其启动子甲基化之间的关系。结果:35例胶质瘤中RUNX3 mRNA和蛋白的光密度比值分别为0.303±0.23 1和0.401±0.217。10例正常脑组织RUNX3 mRNA和蛋白的光密度比值分别为0.767±0.047和0.753±0.042。RUNX3 mRNA和蛋白的表达在正常脑组织和胶质瘤中有显著区别（P＜0.01）。RUNX3 mRNA和蛋白在低级别胶质瘤（Ⅰ-Ⅱ级）中表达为0.428±0.241和0.553±0.196,高级别胶质瘤（Ⅲ-Ⅳ级）中分别为0.208±0.175和0.287±0.154,表明RUNX3 mRNA和蛋白的表达水平随着胶质瘤恶性程度的增加而降低(rmRNA=-0.598,PmRNA＜0.01;rprotein=-0.703,Pprotein＜0.01),并且RUNX3 mRNA和蛋白的表达水平呈正相关（r=0.965,P＜0.01）。MSP显示35例胶质瘤标本中有42.8%（15/35）RUNX3基因启动子发生甲基化,10例正常脑组织中未检测到RUNX3启动子的甲基化,RUNX3启动子甲基化在正常脑组织和胶质瘤中比较有显著的统计学差异（P＜0.01）,并且RUNX3启动子甲基化与肿瘤的恶性程度相关,在低级别胶质瘤中只有20%（3/15）RUNX3启动子甲基化,而在高级别胶质瘤中甲基化率为60%（12/20）。15例RUNX3基因甲基化的胶质瘤中mRNA和蛋白分别为0.1 13±0.098和0.213±0.105,20例未甲基化胶质瘤中mRNA和蛋白分别为0.445±0.197和0.612±0.169,RUNX3启动子高甲基化与mRNA及蛋白表达呈显著负相关（P＜0.01）。结论:RUNX3基因启动子在胶质瘤中异常高甲基化。RUNX3基因启动子高甲基化是RUNX3基因在胶质瘤中表达下调的重要原因,并且RUNX3基因启动子高甲基化在高级别胶质瘤中更为常见。第三部分5-氮胞苷诱导胶质瘤细胞株RUNX3表达和对细胞凋亡、侵袭的影响目的:探讨特异性去甲基化药物5-氮胞苷对胶质瘤母细胞株U-251增殖、凋亡和侵袭能力的影响,以及作用前后RUNX3基因表达和启动子甲基化的情况。方法:常规方法培养U-251细胞。取对数生长期的细胞作为研究对象。运用MTT检测不同浓度5-氮胞苷处理U-251细胞株12小时、24小时、48小时和72小时后对细胞增殖的影响。PI染色经流式细胞仪检测分别用5μmol/L,10μmol/L,20μmol/L和50μmol/L5-氮胞苷处理U-251细胞株后的凋亡情况。运用Transwell检测U-251细胞经过5-氮胞苷处理后的侵袭能力。运用RT-PCR,Western blot和MSP检测药物干预前后RUNX3基因表达和甲基化的情况。结果:U-251细胞株经过不同浓度5-氮胞苷处理后,随着药物浓度的上升和作用时间的延长,药物抑制细胞增殖的作用逐渐增强,即具有量效和时效依赖性。经流式细胞仪检测分析结果显示:经过不同浓度5-氮胞苷处理后,细胞凋亡率由对照组的1.32±0.21%上升至50μmol/L时的39.21±1.32%。各干预浓度下的凋亡率同对照组相比均有明显区别（P＜0.01）。Transwell侵袭小室结果显示随着去甲基化药物作用浓度的上升,U-251细胞侵袭细胞数由阴性对照组的51.3±2.6下降至20μmol/L干预组的29.2±2.3,抑制率达到了43.13%。RT-PCR,Western blot和MSP显示5-氮胞苷作用前,U-251细胞RUNX3启动子是甲基化的,RUNX3mRNA和蛋白表达缺失,在药物干预后,可以检测到RUNX3基因mRNA和蛋白的表达,RUNX3基因启动子甲基化状态被部分逆转,即甲基化与非甲基化并存。结论:5-氮胞苷在体外能有效抑制U-251细胞的增殖、侵袭,并促进其凋亡。5-氮胞苷通过去甲基化作用恢复U-251细胞中RUNX3基因的表达。