癫痫是由不同病因引起的慢性脑疾病,其特征是由于大脑神经元过度放电所引起的具有各种临床和实验室表现的突然、短暂、阵发、反复发作的一组临床综合征,是对人类健康危害极大且发病率较高的疾病。其人群患病率约为5‰。颞叶癫痫(temporal lobe epilepsy, TLE)是以颞叶前内基底部痫灶为主引起的钩回发作,约占整个癫痫病人的60～70%,是部分性癫痫发作的代表。癫痫的发病率与年龄密切相关,不同年龄有不同的病因。一般认为1岁以内患病率最高,其次为1～10岁,以后逐渐降低。由此可见,儿童癫痫占整个癫痫的绝大多数,探讨儿童癫痫具有重要意义。TLE的发病机制十分复杂,尚未明了。海马硬化是TLE最常见的病理改变和主要的病理特征,而神经元变性、坏死、丢失和胶质增生是海马硬化的主要特征之一。建立动物癫痫模型用于人类癫痫发病机制的研究以获取相关信息是目前最流行的方法。点燃模型是迄今为止最理想的人类慢性癫痫模型,更接近于动物自然生理状态,与人类癫痫极为相似,此种癫痫发作反映了人类癫痫发作的许多特征,因此,本实验采用化学点燃模型作为研究人类TLE的动物模型,从整体、器官、细胞、分子水平试图对儿童癫痫的发病机制作一观察和探索,为临床的诊治提供新的思路和方法。业已证明,幼年乃至成年脑中存在神经干细胞和神经发生。在癫痫的发生过程中伴随着海马内神经元丢失、胶质增生和神经发生增加。神经干细胞(Neural Stem Cells, NSCs)作为神经系统的全能细胞,有很强的分裂、增殖能力,且在不同因子作用下,定向分化成神经元和神经胶质细胞。越来越多的资料表明,NSCs所处微环境中的多种因子参与神经发生的调控。Noggin和BMP4在胚胎、幼年和成年CNS表达,提示两者是NSCs正常分化、增殖所需微环境的关键因子。Noggin作为胚胎发育的重要基因,在种属间高度保守。人的Noggin基因定位于染色体17q22,大鼠与小鼠的Noggin基因定位于染色体11,编码产物均为26kD的分泌蛋白。研究证实,Noggin基因的神经诱导功能主要是通过拮抗骨形成蛋白4(Bone morphogenetic protein-4, BMP4)的作用实现的。对另一BMP4拮抗蛋白chordin的研究表明,在神经管关闭后的胚胎期、幼年和成年的CNS,chordin均有广泛表达,提示在胚胎期神经发生中起重要作用的蛋白可能在生后不同阶段CNS的发育中亦有重要作用。已有研究证实,Noggin与BMP4基因对室下区神经发生有调节作用。据此,我们设想Noggin与BMP4基因有可能对另一同样有神经发生的脑区――海马内的神经发育有一定的影响。但两者在PTZ点燃后幼年癫痫大鼠海马神经发育中有无表达,是否在其发病机制中扮演一定的角色,迄今尚缺乏相关报道。鉴此,本研究采用免疫组化、核酸分子原位杂交(ISHH)与逆转录PCR(RT-PCR)等技术先观察Noggin基因与BMP4基因在PTZ点燃后癫痫幼年大鼠海马神经发育中的表达,继而运用5-溴脱氧尿嘧啶核苷(Bromodeoxyuridine, BrdU)标记、免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)等方法探讨二者对幼年癫痫大鼠海马神经发育的影响。主要结果在成功地建立了改良的戊四氮快速点燃幼年癫痫大鼠模型上,先观察了在PTZ点燃后不同发作级别、不同时相点的NSE、nestin在海马内的表达和海马齿状回Timm’s染色,分别发现癫痫组大鼠海马内出现大量NSE阳性细胞,各区反应强度不等,以CA3区最明显,其次为CA1区和DG,CA2区反应较弱;而nestin在PTZ注射后3d时开始出现在齿状回、CA3区和CA1区,到7d时达高峰,以后逐渐减少,60d时降至正常水平。nestin阳性细胞,在海马各区反应强度不等,以DG区最明显,其次为CA3区和CA1,CA2区反应较弱。癫痫组海马NSE和nestin阳性细胞数均大于对照组(P<0.01)。Timm’s染色显示在PTZ点燃后的静止期:齿状回的浅颗粒层和内分子层开始出现MF发芽,并逐渐增加。海马及齿状回各区中量的变性、坏死细胞。而在慢性期齿状回MF发芽进行性增加。海马及齿状回有少量变性、坏死细胞。胶质细胞增生,胶质瘢痕形成,海马萎缩。在观察海马存在神经元损伤和胶质增生的基础上,再动态地观察了Noggin和BMP4的mRNA和蛋白的表达变化:PTZ点燃后Noggin免疫反应样阳性细胞明显增多,7d达到高峰,以后逐渐下降,60d后恢复至对照组水平;BMP4免疫反应样阳性细胞亦明显增多,5d达到高峰,以后逐渐下降,90d后仍高于对照组水平。而MP4 mRNA原位杂交:在PTZ注射后7d时开始增多,在点燃后5d时达高峰,以后逐渐下降,至60d时仍有较高表达,以DG区最明显,其次为CA3区,CA1和CA2区反应较弱。采用RT-PCR技术则显示海马Noggin mRNA表达水平明显上调,7d时达到最高峰,以后逐渐下降,60d后降至点燃前水平;海马BMP4 mRNA表达水平亦明显上调,5d时达到最高峰,以后逐渐下降,90d后降至点燃前水平。采用Noggin的反义寡核苷酸技术封闭内源性Noggin基因的表达观察其对幼年癫痫大鼠海马神经发育的影响:注射Noggin反义寡核苷酸后,癫痫大鼠海马内Noggin mRNA阳性细胞数明显降低,而BMP4 mRNA阳性细胞数无明显变化,同时大鼠海马齿状回和齿状回颗粒细胞下区的BrdU阳性细胞数均较正常对照组明显降低,提示Noggin基因转录受抑制可降低癫痫海马神经前体细胞的增殖。主要结论:1.成功地建立了类似于人类TLE特征的慢性癫痫动物模型,为研究人类TLE发病机制、电生理特征等提供了较理想的研究平台。2.PTZ点燃癫痫形成过程中伴有神经元损伤、胶质增生、苔藓纤维发芽。3.Noggin和BMP4在幼年癫痫大鼠海马内表达上调。4. Noggin在海马神经前体细胞向神经元转化、新生神经元可塑性改变、异常的兴奋性回路形成方面可能起促进作用;5.BMP4在海马组织胶质化,慢性癫痫反复自发性发作及长期维持方面可能起一定的作用。本研究初步探讨了Noggin和BMP4参与幼年癫痫大鼠海马神经发育的影响,两者在癫痫发生、发展过程中均起一定的作用。进一步研究Noggin和BMP4的作用机制对调控癫痫的神经发生和神经可塑性、防止癫痫形成及癫痫脑组织损伤,达到真正内源性结构修复和脑高级功能的重建可能有一定的意义,从而为癫痫后原位诱导内源性神经干细胞增殖、分化、进行自我修复提供了可能性。