【摘 要】
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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)受嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后可诱发严重的败血症。本课题组前期在草鱼易感和抗病群体中鉴定获得9个关键miRNA,本论文针对miR-21和miR-142a-3p进行后续功能分析,发现草鱼miR-21可以通过靶向jnk和ccr7调控由A.hydrophila诱导的炎症反应,miR-142a-3p通过靶向tnfai
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草鱼(Ctenopharyngodon idellus)受嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)感染后可诱发严重的败血症。本课题组前期在草鱼易感和抗病群体中鉴定获得9个关键miRNA,本论文针对miR-21和miR-142a-3p进行后续功能分析,发现草鱼miR-21可以通过靶向jnk和ccr7调控由A.hydrophila诱导的炎症反应,miR-142a-3p通过靶向tnfaip2和glut3调控由A.hydrophila感染引起的炎症反应。主要研究结果如下:1.草鱼miR-21在嗜水气单胞菌和LPS(革兰氏阴性细菌的内毒素)感染过程中呈现下降趋势,通过生物信息软件预测获得miR-21的靶基因jnk和ccr7,miR-21同jnk和ccr7在嗜水气单胞菌感染过程中表达模式呈负相关。过表达miR-21可以显著抑制jnk和ccr7的表达;抑制miR-21后,jnk和ccr7的表达水平显著增加。双荧光素酶报告系统进一步证实了miR-21对jnk和ccr7靶向调控作用。miR-21通过靶向jnk和ccr7抑制下游促炎症因子,tnf-α,il-1β,il-6以及il-12。2.通过生物信息软件预测获得miR-142a-3p的潜在靶基因tnfaip2和glut3,嗜水气单胞菌感染过程中发现tnfaip2和glut3表达量均上升,与miR-142a-3p表达模式呈负相关趋势;miR-142a-3p过表达显著抑制tnfaip2和glut3,抑制miR-142a-3p使得tnfaip2和glut3表达上升;双荧光素酶报告系统进一步证实了miR-142a-3p对tnfaip2和glut3靶向调控作用。miR-142a-3p靶向tnfaip2和glut3调控下游促炎因子(tnf-α,il-1β以及il-8)的表达水平;促进Kupffer细胞(草鱼肝脏巨噬细胞)极化至M2型。CCK-8和Caspase-Glo3/7检测结果显示,抑制miR-142a-3p促进了细胞存活,过表达miR-142a-3p促进凋亡,表明miR-142a-3p可以靶向tnfaip2和glut3诱导细胞凋亡。3.从草鱼全基因组数据库中鉴别出4个JNK与6个p38基因,分别分布在24条染色体的7条中。蛋白质保守结构域分析发现它们都含有双磷酸化位点(JNKs:Thr-Pro-Tyr,p38:Thr-Gly-Tyr)。JNK和p38家族基因在正常状态下中表达水平较低。细菌感染后,jnk3,p38 beta,p38 gamma a和p38 gamma b的表达量显著上调,说明它们在细菌感染后的免疫应答中具有潜在作用。
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