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目的:卵巢上皮性癌(简称卵巢癌)是目前病死率最高的妇科恶性肿瘤,5年生存率一直徘徊在30%左右。治疗难点为对化疗药物,尤其是一线化疗药物顺铂产生耐药性,成为肿瘤化疗失败及肿瘤复发的主要原因。提高卵巢癌细胞对顺铂的敏感性对临床化疗和提高生存率有重要意义。本课题组前期研究发现间皮素基因是卵巢癌组织中表达上调最显著的基因,并且发现间皮素过表达与基因沉默对卵巢癌细胞株的增殖、粘附、迁移和侵袭力的影响有显著差异。Cheng WF等[1]研究发现组织中高表达间皮素的卵巢癌患者,发生化疗耐药的机率高,且生存期要短于低表达间皮素的患者,认为间皮素与卵巢癌患者的临床化疗耐药和预后有关。本研究目的:检测间皮素在卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP、3AO/DDP及其亲本细胞株SKOV3、3AO中的表达差异,并利用慢病毒介导的RNA干扰(RNA interference RNAi)沉默人浆液性卵巢癌耐药细胞株SKOV3/DDP中间皮素基因的表达,创建了降调间皮素的稳转细胞株(SKOV3/DDP-MSLN- RNAi、SKOV3/DDP-MSLN-neg);利用创建的稳转细胞株,观察间皮素基因沉默后SKOV3/DDP细胞的增殖情况及对顺铂敏感性的变化,初步探讨间皮素基因与卵巢癌耐药的关系。方法:1 MTT法分别检测卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP、3AO/DDP和亲本细胞SKOV3、3AO的半数抑制浓度(IC50),计算耐药指数(resistance index,RI),RI= IC50(耐药细胞)/ IC50(亲本细胞)。2采用荧光定量PCR和Western blotting方法分别从基因和蛋白水平检测卵巢癌细胞SKOV3、3AO及其顺铂耐药细胞SKOV3/DDP、3AO/DDP中间皮素表达水平的差异。3分别用LV-MSLN-RNAi(间皮素RNAi慢病毒液)、LV-MSLN-negative (空载体慢病毒液)转染SKOV3/DDP细胞,转染96h后激光共聚焦荧光显微镜下观察细胞荧光表达情况,并计算转染效率,了解LV-MSLN-RNAi转染对SKOV3/DDP细胞的间皮素基因沉默效果。两种慢病毒液转染的细胞分别表示为:SKOV3/DDP-MSLN-RNAi(实验组,干扰组)和SKOV3/DDP-MSLN-neg(阴性对照组),SKOV3/DDP作为空白对照组。4利用Western blotting检测SKOV3/DDP-MSLN-RNAi、SKOV3/DDP- MSLN-neg、SKOV3/DDP细胞中间皮素蛋白的表达,计算干扰效率,验证慢病毒液转染后间皮素蛋白的沉默效果,了解转染后的细胞是否满足后续实验要求。5应用MTT法检测SKOV3/DDP-MSLN-RNAi、SKOV3/DDP-MSLN- neg与SKOV3/DDP细胞培养24、48、72小时后的增殖情况。用平板克隆形成实验进一步检测各组细胞生长增殖能力。6应用MTT法检测SKOV3/DDP-MSLN-RNAi、SKOV3/DDP-MSLN- neg与SKOV3/DDP细胞暴露于不同浓度顺铂48小时后生存率的改变和半数抑制浓度的变化。7利用流式细胞术检测SKOV3/DDP-MSLN-RNAi、SKOV3/DDP-MSLN -neg、SKOV3/DDP三组细胞的凋亡率及三组细胞在3mg/L顺铂作用48h后的凋亡率,分析间皮素基因沉默后卵巢癌耐药细胞对顺铂的敏感性变化。8统计学方法:数据统计采用SPSS 13.0统计软件处理,计量资料以均数±标准差表示,方差齐性检验,组间的比较采用方差分析,以α=0.05为检验水准,当P<0.05时,差异有统计学意义;当P>0.05时,差异无统计学意义。结果:1 SKOV3/DDP的耐药指数为4.52,3AO/DDP的耐药指数为4.22,满足后续实验要求。2间皮素在卵巢癌顺铂耐药细胞株中的表达高于敏感细胞株:2.1实时荧光定量PCR发现:SKOV3、SKOV3/DDP、3AO和3AO/DDP四种细胞中均可检测到间皮素mRNA的表达,且间皮素mRNA组间比较差异具有统计学意义(F=26.4,P<0.01)。在顺铂耐药细胞SKOV3/DDP、3AO/DDP中间皮素mRNA表达高于敏感细胞SKOV3、3AO,差异具有统计学意义(P<0.01);间皮素mRNA在SKOV3/DDP表达高于3AO/DDP,差异具有统计学意义(P<0.01);间皮素mRNA在SKOV3表达高于3AO,差异具有统计学意义(P<0.05)。2.2 Western blotting结果显示:SKOV3、SKOV3/DDP、3AO和3AO/DDP细胞间皮素蛋白表达值分别为(0.3士0.13), (0.9士0.14), (0.1士0.08), (0.7士0.12),且组间比较差异有统计学意义(F=61.5,P<0.01)。顺铂耐药细胞株SKOV3/DDP、3AO/DDP间皮素蛋白表达高于敏感细胞株SKOV3、3AO,差异有统计学意义(P<0.01)。SKOV3/DDP中间皮素蛋白表达高于3AO/DDP,差异有统计学意义(P<0.01)。SKOV3间皮素蛋白表达高于3AO,差异有统计学意义(P<0.01)。3慢病毒液转染SKOV3/DDP细胞96h后,激光共聚焦荧光显微镜下观察转染细胞中荧光细胞的数量,证实慢病毒液对细胞的转染效率为80%-90%,满足后续实验要求。4 Western blotting结果显示转染成功后耐药细胞间皮素降低:SKOV3/DDP细胞转染成功后,SKOV3/DDP-MSLN-RNAi间皮素蛋白的表达被有效沉默,其干扰效率可以达到95.7%,阴性对照组SKOV3/DDP- MSLN-neg细胞与空白对照组SKOV3/DDP细胞相比,间皮素的表达无显著性差异(P>0.05)。5 MTT法测定转染成功后耐药细胞增殖率减慢:各组细胞常规培养24、48、72小时后,分别比较各个时间点实验组(干扰组SKOV3/DDP-MSLN- RNA i ),阴性对照组(SKOV3/DDP-MSLN-neg)和空白对照组(SKOV3/DDP)的细胞增殖率,差异有统计学意义(P<0.05)。干扰组细胞增殖率低于阴性对照组和空白对照组(P<0.05),后两组间细胞增殖率无明显差别(P>0.05)。6平板克隆形成实验结果显示:实验组克隆形成率为(24.6士0.6)%,阴性对照组为(45.01士1.9)%,空白对照组为(45.7士1.5)%,结果比差异有统计学意义(P<0.01)。实验组细胞克隆形成率明显低于其他两组(P<0.01),阴性对照组和空白对照组之间克隆形成率无明显差别(P=0.44>0.05)。7 MTT法测定转染后SKOV3/DDP细胞对顺铂敏感性增强:间皮素基因沉默后卵巢癌耐药细胞随顺铂作用浓度增加,细胞抑制率增加明显。实验组细胞IC50为(2.7士0.16)ug/ml,阴性对照组IC50为(5.3士0.42)ug/ml、空白对照组IC50为(5.4士0.26)ug/ml,实验组细胞与阴性对照组、空白对照组比较,细胞抑制率差异有统计学意义(P<0.01)。后两组比较,细胞抑制率差异无统计学意义(P=0.38>0.05)。8流式细胞术检测细胞凋亡率增加:8.1检测转染后的耐药细胞,实验组SKOV3/DDP-MSLN-RNAi细胞凋亡率为(16.4±2.54)%,阴性对照组SKOV3/DDP-MSLN-neg为(1.9±0.9)%,空白对照组SKOV3/DDP为(2.4±0.82)%,结果比较差异有统计学意义(F=78.4, P<0.01)。实验组细胞凋亡率高于阴性对照组(P<0.01)与空白对照组(P<0.01),差异有统计学意义。阴性对照组与空白对照组比较,凋亡率差异无统计学意义(P=0.74>0.05)。8.2排除间皮素降调引起的细胞凋亡,实验组SKOV3/DDP-MSLN-RNAi阴性对照组SKOV3/DDP-MSLN-neg和空白对照组SKOV3/DDP细胞单纯因顺铂处理引起的凋亡率实分别为(39.9士5.46)%,(18.7士7.06)%,(19.7士5.42)%,结果比较差异有统计学意义(F=11.8,P=0.008)。实验组细胞凋亡率与其他两组比较,差异有统计学意义(P<0.01)。空白对照组和阴性对照组比较,差异无统计学意义(P=0.85>0.05 )。结论:1间皮素在卵巢癌顺铂耐药细胞株中表达高于敏感细胞株。提示间皮素过表达与卵巢癌细胞顺铂耐药间存在明确的相关性。2 RNAi沉默间皮素基因可以降低卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP的生长增殖能力。3 RNAi沉默间皮素基因能够提高卵巢癌耐药细胞SKOV3/DDP对化疗药物顺铂的敏感性,增加细胞凋亡率。提示降调间皮素蛋白可能逆转卵巢癌细胞的顺铂耐药。