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氧化磷酸化通路是动物细胞中最重要的生化过程,作为呼吸链的最终代谢途径,氧化磷酸化所产生的生物能量——三磷酸腺苷是支撑多种基础细胞途径的动力源。与生物体内其它通路相比,氧化磷酸化系统的构成较为特殊,它是由线粒体基因与核基因编码的蛋白共同组成,两者通过紧密无间的合作来维持系统的正常运作。在基因组间相互作用的研究领域中,氧化磷酸通路具有一定的代表性而受到人们的关注。 Dobzhansky-Muller理论的提出,使人们认识到基因间适应性进化在物种形成机制中的重要地位。其中,由于氧化磷酸化通路的特殊构成,以及它在细胞功能中的重要地位,在生殖细胞中若存在线粒体基因与核基因编码蛋白之间不匹配的情况,就会导致合子后生殖隔离发生。处于自然界中的动物,其线粒体基因组一直受到自然选择的作用,相对应的核基因也会产生互补性的进化,最终可能将物种导向不同的进化方向。 本文研究的对叶榕传粉榕小蜂Ceratosolen solmsi,采自中国海南省万宁市,在先前的研究中发现同一区域的对叶榕树上所采集到的该种榕小蜂存在被沃尔巴氏菌感染以及未被感染的两种个体,经分子实验鉴定发现两种个体之间的线粒体基因序列有明显的差异,但缺少核基因方面的信息来阐明两种小蜂之间的进化关系。而已有的研究在膜翅目昆虫的意蜂、金小蜂、阿根廷蚁利用线粒体生物产能相关的核基因在这些物种的亚种之间进行验证实验,证明了线粒体氧化磷酸化相关核基因与这些物种分歧之间存在一定的联系。因此,本研究基于上述的理论利用线粒体氧化磷酸化相关核基因与线粒体基因来研究两种小蜂在进化上的关系,并结合细胞内的另一个存在—沃尔巴氏菌,探讨内共生菌在这个微环境中所扮演的角色。 先利用引物wsp、ftsZ以及16S rRNA对单果收集的C.solmsi样本进行沃尔巴氏菌的感染情况鉴定,发现感染的小蜂个体与未被感染的个体基本是分布在不同的榕果中,来自两棵对叶榕树的30个榕果中,每个果选取的10-20个样本里,全是未感染个体的榕果有28个,1个榕果内全部为感染个体,仅在一个榕果内发现同时存在感染与未感染的个体。推测感染与未感染的C.solmsi已分化为同一区域内的两个不同群落。 进一步通过PCR实验分别获得沃尔巴氏菌感染以及未感染的小蜂个体的氧化磷酸化相关线粒体基因与核基因序列,利用PAML、MAPP等软件对这些基因进行选择压力以及功能性限制位点分析。通过在10个近缘物种的氧化磷酸化相关基因重建的系统发育树的基础上分析结果得出:线粒体基因仅有来自复合物Ⅰ中的NADH4基因,其在沃尔巴氏菌感染的C.solmsi中所受到的选择压力程度明显异于未感染的C.solmsi(约4倍)。基于此,氧化磷酸化相关的核编码基因方面则有4个来自沃尔巴氏菌感染的C.solmsi以及2个来自未感染的C.solmsi,含有可能受到正向选择作用的氨基酸位点。MAPP软件预测结果显示:有6个氧化磷酸化相关核基因来自感染的C.solmsi以及3个来自未感染的C.solmsi,其蛋白序列中含有潜在的功能性限制位点。这些氨基酸位点中,又有5个候选位点在感染与未感染的C.solmsi之间表现出不同的物理化学性质,并且其中有3个氨基酸位点定位于稳定性较差的二级结构—无规卷曲。蛋白质三级结构分析结果显示,仅有一个蛋白-Core proteinⅡ在沃尔巴氏菌感染与未感染的C.solmsi之间表现出蛋白构象水平的差异,该差异有可能是由于该构象附近区域内的一个氨基酸突变所致。综合上述结果认为,沃尔巴氏菌感染与未感染的C.solmsi的氧化磷酸化相关线粒体以及核编码基因在进化水平上已出现分歧,并且核编码基因的进化事件有更多的发生在沃尔巴氏菌感染个体中的趋势。这些结果有可能预示着沃尔巴氏菌已经介入到C.solmsi物种的氧化磷酸化相关基因的进化过程中。沃尔巴氏菌通过影响宿主的线粒体基因组,间接的导致与线粒体基因相对应的核编码基因在进化过程中发生功能性限制减弱的现象,从而引导宿主的氧化磷酸化系统产生新的进化动向。 已有的研究结果已证实存在于线粒体中的沃尔巴氏菌能够影响宿主的线粒体基因组,结合本研究的结果,提出沃尔巴氏菌—线粒体基因—线粒体氧化磷酸化相关核基因的作用链,将内共生学说与基因间适应性进化联系起来,提出一个新颖的基因进化模型。