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目的:通过生物信息学技术分析肠道病毒D68型(EV-D68)的衣壳蛋白VP1的特性,并筛选出4个VP1蛋白最可能的B细胞表位,合成肽段,构建EV-D68多肽疫苗。通过原核表达系统诱导表达重组VP1蛋白,运用镍离子金属鳌合亲和层析的方法纯化目的蛋白,构建病毒亚单位疫苗。将以上两种疫苗免疫小鼠,检测特异性抗体的产生和中和抗体的作用,比较两种疫苗的免疫保护效果。方法:应用Bioedit、ExPASy、ProtParam等多种生物信息学工具,对EV-D68 VP1蛋白的理化性质、结构功能和B细胞表位进行预测,并对B细胞表位肽段进行筛选,合成筛选出的肽段并偶联KLH蛋白,PBS溶解后与等量氢氧化铝佐剂混合,制备成多肽疫苗。应用PCR技术扩增EV-D68的VP1基因,并克隆到原核表达载体pET28a(+)上,构建重组质粒pET28a(+)-VP1。重组质粒经双酶切和测序鉴定后,转化大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG诱导表达蛋白。表达的目的蛋白用镍离子金属鳌合亲和层析的方法纯化,浓缩后的蛋白溶液与等量氢氧化铝佐剂混合,制备成亚单位疫苗。将多肽疫苗和亚单位疫苗分别腹腔注射免疫小鼠,检测血清中抗体的产生和中和抗体的作用,比较两种疫苗的保护效果。结果:对EV-D68的VP1蛋白进行了生物信息学分析,预测了其基本的理化性质、结构功能。预测结果为:蛋白是等电点8.73、相对分子量34.0KD的亲水性蛋白,可能具有35个可能的磷酸化位点,预测没有信号肽和跨膜区,二级结构中不规则卷区有最高的比例,α-螺旋和β-折叠散落在蛋白中,预测VP1蛋白具有多个可能的B细胞表位并筛选出了4个最佳表位(第39-59、82-102、163-181、275-289位氨基酸),将筛选出的肽段进行合成,偶联KLH蛋白,用PBS溶液溶解并与等量氢氧化铝佐剂混合,成功构建出了5组多肽疫苗(第5组为第1组和第2组的联合多肽疫苗)。PCR成功扩增了EV-D68的VP1基因,构建的重组质粒pET28a(+)-VP1双酶切鉴定结果符合预期,测序结果与GenBank一致。IPTG成功诱导表达了VP1蛋白,并通过镍离子金属鳌合亲和层析技术得到了纯化的目的蛋白,将蛋白溶液与等量氢氧化铝佐剂混合,成功构建出了亚单位疫苗。用构建的两种疫苗免疫小鼠,WB检测到小鼠血清中EV-D68特异性抗体,该抗体具有良好的效价,且对于EV-D68的两个毒株EVD68/Fermono和EV-D68/US/IL/14-18952均可产生效价。微量血清中和试验检测抗体对病毒的中和作用,显示抗体不具备中和作用。结论:应用生物信息学分析技术分析蛋白的结构和预测蛋白的表位具有可行性,成功构建了病毒的多肽疫苗;成功构建了VP1蛋白的原核表达载体,表达纯化了VP1蛋白,成构建了病毒的亚单位疫苗。两种疫苗具有良好的免疫原性,但是产生的特异性抗体不具备中和作用。