植物microRNA (miRNA)是广泛分布于植物基因组中的长度在19-25个核苷酸的内源性非编码调控RNA,是真核生物基因表达的一类调控因子,主要通过指导靶基因的切割或降低靶基因的翻译从转录后水平上调控植物基因表达,在控制植物的发育、开花时序、新陈代谢、应激反应等方面起着重要的作用。目前,分离和鉴定miRNA的方法主要包括实验方法(遗传筛选、直接克隆、高通量测序、northern杂交、荧光定量PCR)和生物信息学方法。柑橘是世界性的重要水果。枳(Poncirus trifoliata)是绝大多数柑橘品种的一种优良砧木。它是柑橘学研究的重要对象,有关枳分子生物学的研究备受重视。在重要经济植物上开展miRNA及其靶基因的研究,为从表观遗传学方面解释更多的重要生命现象,达到有效调控与利用重要功能基因的目的具有重要意义。本论文以枳和柑橘中的’Nules’、‘宫本’、‘纽荷尔’为试验材料,通过生物信息学预测了柑橘中的niRNA及其靶基因,并用Northern杂交、miR-RACE、RLM-5’-RACE、qRT-PCR、高通量测序以及PPM-RACE和RLM-RACE系统全面的研究了枳、宽皮橘和甜橙中的miRNA及其靶基因的表达。主要研究结果如下：1.用生物信息学预测miRNA的方法,从NCBI数据库中柑橘的EST中挖掘miRNAs。通过采取一系列的筛选条件,从四种柑橘的430,000EST序列中找到了38个潜在的miRNAs:枳(Poncirus trifoliata)中9个miRNAs(命名为ptr-miRNAs);克莱门柑(C.clementine)中5个miRNAs (ccl-miRNAs);宽皮橘(C. reticulata)中9个(crt-miRNAs);甜橙(C. sinensis)中15个(csi-miRNAs)。其中8个用Northern杂交表明在枳的根、茎和叶中都有表达,但是表达量不同。用潜在的miRNA序列,进一步对NCBI中mRNA数据库的BLAST搜索,在柑橘的数据库中发现10个靶基因。用RNA连接酶介导的5’RACE研究了miRNA对其靶基因的调控作用,结果表明枳中这些(?)miRNAs对其靶基因是通过mRNA剪切来行使功能的。2.报告一个有效的方法来确定生物信息学预测的miRNA精确序列。这个方法主要包括小RNA文库的构建,miRNA的5’RACE、3’RACE和RACE产物的克隆测序。该方法创新的核心步骤是miRNA的5’RACE和3’RACE特异引物的设计。进一步利用RLM-5’RACE来验证miRNA对其靶基因的剪切和荧光定量RT-PCR来研究精确序列的表达。结果表明利用这种有效的新的方法验证了枳中生物信息学预测的9个miRNAs的精确序列。用和枳中相同的引物miR-RACE可以验证葡萄和苹果生物信息学预测的精确的序列。这种方法可以克服生物信息学法预测miRNA的的主要缺点不能确定miRNA在前体上的精确序列,可能是miRNA研究非常有用的工具。3.用Solexa深度测序技术发现在枳中新的microRNA。从枳花芽、花以及不同发育时期的果实构建的小RNA文库中,总的13,106,753序列代表4,876,395独立的序列被克隆测序。基于miRNA相似性序列和二级结构预测,从克隆测序的156,639序列中发现63个miRNA属于42个高度保守的miRNA家族,与已知miRNA的完全匹配。我们还从枳中发现10个新的miRNAs,其前体从柑橘的560,271条EST中被确定,而且其中的5个miRNA其miRNA*也被克隆和测序。此外,定量RT-PCR研究了这10个新的候选的miRNA表达在枳不同发育时期不同组织基因的表达。对大多数保守的和新的miRNA潜在的靶基因进行了预测,其中4个靶基因,包括一个编码铜离子结合/还原酶的IRX12基因和另外3个编码NB-LRR类抗病蛋白的基因在转录水平上受miNRAs调控。对枳花和果小RNA测序发现10个新的miRNA和42高度保守的miRNA家族,这表明特异的miRNA在枳中存在。4.为了研究枳在生长发育时期miRNA及其靶基因的表达特性,利用生物信息学方法和RACE技术从枳的不同发育时期根、茎、叶、花、果等不同器官构建的cDNA文库中克隆了9个miRNA的10个靶基因的全长,采用荧光定量RT-PCR以及PPM-RACE和RLM-RACE方法分析13个miRNA及其靶基因和miRNAs剪切靶基因产物(5’端和3’端)在枳叶(直径大小分别是0.2,0.5和1 cm)、幼茎、老茎、根、花芽、花和果(直径大小分别是0.5,1.5,和2cm)等15种不同器官中的表达水平。结果表明枳miRNA和其靶基因在枳不同发育时期的不同器官中存在着相互消长的关系,在枳的组织发育和成熟过程中miRNA含量逐渐降低,而它的靶基因的含量逐渐上升。5.利用miR-RACE鉴定了生物信息学预测的9个宽皮橘和15个甜橙miRNA精确序列。采用荧光定量RT-PCR方法分析了这些miRNAs及其靶基因分别在宽皮橘和甜橙的幼茎、成熟茎、老茎、幼叶、成熟叶、老叶、花芽、花蕾、花和果(花后15天,花后45天,花后75天,花后105天,花后145天)等14种不同器官中的表达水平。用一种新的miRNA介导的靶基因检测剪切片段的方法PPM-RACE和RLM-RACE验证了miRNA潜在的靶基因。PPM-RACE和RLM-RACE不但可以验证靶基因的剪切位点,而且能够检测剪切片段的表达模式从而知道miRNA与靶基因的作用方式。实验结果表明miRNA在发育转变、花的发育以及果实的成熟等多以切割靶基因模式来调控靶基因的表达,从而拓展了小RNA介导地调控机制。6.用已知27个拟南芥miRNAs与柑橘的EST数据库进行比对来寻找柑橘miRNA的前体,其中13个柑橘的miRNA前体序列可以形成类似与拟南芥的二级结构。Northern杂交结果表明26个miRNAs在柑橘的叶片、幼梢、花、果实和根中都是普遍表达的,其中一些miRNA在不同的组织中其表达量不同。基于miRNA与靶序列完全或近乎完全的互补特性,在总共从15个柑橘miRNA中找到41个潜在的靶基因。其中的四个靶基因在枳中mRNA水平上已被实验证实在被miRNA剪切。