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人参为五加科多年生草本植物,是名贵的中药材。研究表明,其主要次生代谢产物人参皂苷,在调节人的中枢神经系统、提高免疫力、抗疲劳、抗氧化、抗肿瘤、降血糖等方面有着很好的功效,因此被广泛用于药品、保健品、化妆品等各类产品中,具有可观的经济价值和广阔的应用前景。但是,由于野生人参资源匮乏、栽培周期长、人参品质易受环境影响等,导致高品质人参的市场供应量较少、价格昂贵。本研究主要是通过分析人参发根体细胞胚胎发生初期相关基因的表达情况,为进一步建立高效稳定的人参发根体细胞胚胎发生体系打下坚实的基础。人参发根是由发根农杆菌侵染人参根部诱导所产生的组织,以其为外植体进行人参体细胞胚胎发生具有诸多优点,这一技术已成为人参快速繁殖和种质创新的重要手段。在本研究,以人参发根为外植体进行愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导及继代培养,选定与植物体细胞胚发生相关的LBD家族、MAPK家族、WRKY家族转录因子中的LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6、WRKY27基因,利用半定量PCR及荧光实时定量PCR技术对以上基因在人参发根体细胞胚胎发生初期阶段的表达情况进行分析。本研究内容如下:1.以本实验室培养的人参发根为材料,进行发根继代培养、愈伤组织及胚性愈伤组织的诱导和继代培养,得到实验所需的四种不同发育阶段的组织材料。2.根据植物体细胞胚胎发生的文献报道,查阅GenBank中其他植物相关基因的核酸序列,利用同源比对的方法设计引物,成功克隆人参5S rRNA基因及LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6、WRKY27基因核心片段并进行测序。3.通过半定量PCR研究6个目的基因在人参发根体细胞胚胎发生初期四种不同发育阶段的表达情况。选取人参5S rRNA基因为内参基因,对LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6和WRKY27基因表达情况进行半定量分析。半定量PCR结果显示,这6个基因在人参发根体细胞胚胎发生初期四种不同发育阶段的表达水平均存在明显差异,因此推测这6个基因与人参发根体细胞胚胎发生初期阶段相关。4.分别对6个目的基因的表达情况进行荧光实时定量PCR检测,荧光实时定量PCR结果与半定量PCR结果基本一致,进一步证实人参LBD29、MAPK4、MAPK6、WRKY3、WRKY6、WRKY27基因与人参发根体细胞胚胎发生初期阶段相关。5.成功克隆得到人参WRKY6基因CDS序列。测序结果显示,人参WRKY6基因长度为1041bp,其与西洋参PqWRKY6核酸序列相似度为99.61%,氨基酸序列相似度为97.63%。生物信息学分析表明,该核酸片段为人参WRKY6基因CDS序列,命名为PgWRKY6并提交GenBank(检索号:KT277547.1)。