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目的:
近年来,2型糖尿病(T2DM)的发病率逐年增高,已经逐渐成为严重的健康和社会问题。2型糖尿病的发病主要体现为胰岛素抵抗及胰岛细胞功能受损。Glut-4主要位于细胞内,在脂肪和肌肉组织中转运葡萄糖,钙离子作为重要的细胞内第二信使参与了该过程。肥胖是引起胰岛素抵抗的重要危险因素,近年来研究发现Ghrelin与肥胖及胰岛素抵抗有着密切关联。Ghrelin是1999年日本科学家Kojima等首先从大鼠胃黏膜及下丘脑发现的一种新的脑肠肽激素,由28个氨基酸组成,为生长激素促分泌激素受体的内源性配体,主要由胃底X/A样细胞分泌,可以调节进食和糖代谢,对能量代谢平衡起着重要作用。大量文献证实:RYGB术后空腹Ghrelin明显上升,对血糖的调控明显改善。推测胰岛素抵抗改善的机制可能与Ghrelin的调节有关。本实验选取骨骼肌细胞作为研究对象,着重研究胰岛素抵抗的骨骼肌细胞质钙离子的变化及Ghrelin对钙离子稳态的维持作用,以及其引起的细胞内Glut-4的变化。有利于了解Ghrelin缓解胰岛素抵抗的机制。
材料与方法:
培养、分化L6成肌细胞为成熟的骨骼肌细胞,建立胰岛素抵抗模型。细胞随机分组,以单纯胰岛素处理细胞作对照,棕榈酸处理细胞作为研究对象,检测胰岛素抵抗形成过程中钙离子的变化。以单纯胰岛素处理细胞作对照,棕榈酸处理组、三种Ghrelin处理组为研究对象,分别采用葡萄糖氧化酶法、流式细胞仪、激光共聚焦显微镜,检测Ghrelin对棕榈酸诱导的胰岛素抵抗的缓解作用、细胞质游离钙离子水平变化及Glut-4的水平变化。了解Ghrelin维持钙稳态、加强Glut-4水平,改善骨骼肌胰岛素抵抗的机制。
统计学处理:
每组实验n=3,实验重复3次,计量资料采用均数±标准差((X)±s)表示,SPSS13.0统计软件进行统计,组间参数比较采用单因素方差分析,P<0.05为差异具有显著性。
实验结果:
一、葡萄糖氧化酶法鉴定胰岛素抵抗模型
0.3mmol/L棕榈酸干预时间干预24小时后,上清中葡萄糖浓度明显高于对照组(P<0.05),葡萄糖消耗量降低,说明棕榈酸组骨骼肌细胞葡萄糖摄取能力明显下降,证明棕榈酸诱导骨骼肌细胞胰岛素抵抗成功。
二、胰岛素抵抗的骨骼肌细胞质游离钙离子的变化
流式细胞仪检测棕榈酸作用24、36小时与未经棕榈酸作用的同组骨骼肌细胞质阳性荧光钙离子百分比相比较呈下降趋势,差异具有显著性(P<0.05),48小时差异不具有显著性(P>0.05);棕榈酸作用1、6、12小时与未经棕榈酸作用的同组骨骼肌细胞质阳性荧光钙离子百分比相比较呈升高趋势,差异具有显著性(P<0.05)。
三、Ghrelin对胰岛素抵抗的骨骼肌细胞糖代谢的影响
酰化Ghrelin处理组(AG组)、非酰化Ghrelin处理组(UG组)、Obestatin处理组(OB组)培养基上清液葡萄糖浓度与棕榈酸处理组(PA组)细胞上清液葡萄糖浓度相比较下降,差异具有显著性(P<0.05)。
四、Ghrelin对胰岛素抵抗骨骼肌细胞质游离钙离子及Glut-4的影响
经三种Ghrelin作用的胰岛素抵抗细胞与未经Ghrelin作用的胰岛素抵抗细胞相比较,细胞内钙离子上升,差异具有显著性(P<0.05),同时细胞内Glut-4水平上升,差异具有显著性(P<0.05),且与钙离子变化趋势一致。
结论:
1、钙离子参与骨骼肌细胞胰岛素抵抗形成过程,胰岛素抵抗形成后细胞内游离钙离子水平下降。
2、Ghrelin可通过影响钙离子改善胰岛素抵抗、加强细胞内Glut-4的作用。