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鼻咽癌（Nasopharyngeal Carcinoma，NPC）是我国南方地区（广东、广西、湖南、福建）常见的恶性肿瘤，其病理类型90％以上为低分化鳞癌，目前其主要治疗手段为放射治疗。据文献报道，早期鼻咽癌患者经放射治疗，其5年生存率在40-50％左右，而鼻咽癌第二次放疗仅25％患者有效，5年生存率下降为12～23％，且放射损害大，肿瘤细胞对第三次放疗则基本失去了敏感性，因此探讨如何增强鼻咽癌对放疗的敏感性以提高鼻咽癌的放射治疗效果有重要临床意义。 长期以来，无论单纯的立体定向放疗（stereotactic radiotherapy）、立体适形放疗（stereoconformal radiotherapy）、非常规分割放疗，还是使用高压氧、热疗及博莱霉素、硝基咪唑等放射增敏剂，均不能明显增加鼻咽癌对放疗的敏感性。近年随着肿瘤生物治疗学的发展，将基因治疗和放射治疗结合已成为恶性肿瘤治疗的新策略。 本课题即利用Egr-1（Early growth response 1）基因启动子的放射诱导性调控自杀基因表达进行鼻咽癌基因-放射治疗的实验研究。 Egr-1基因编码533个氨基酸的核酸蛋白转录因子，Egr-1基因的启动子含6个高度保守的CC（A+T）6GG结构域，电离辐射产生的活性氧类介质作用于CC（A+T）6GG结构域可显著增强下游基因表达。因此与传统治疗比较，本研究除可以实现射线和下游自杀基因／前体药物系统对鼻咽癌细胞的双重杀伤作用外，同时利用Egr-1基因启动子的放射诱导特性，还可以实现鼻咽癌基因治疗的靶向性，因为日益完善的立体定向放疗（stereotactic radiotherapy）技术可以将射线束准确地照射肿瘤组织，有效地控制肿瘤组织和正常组织的照射剂量，从而通过辐射束的靶向性和可控性实现鼻咽癌靶向性的基因治疗，这对于提高鼻咽癌的治疗效果有重要意义。中南人学 博士学位论义 研究中，我们选择酵母菌CD／UPRT融合基因为Egr一启动子的下游基因，该基因具有优越的抗肿瘤特性，综合了CD和UPRT基因的功能，与单独使用CD基因比较可以更高效率地将无细胞毒性的5FC转化为细胞毒性的5－FU，而5FU具有杀伤肿瘤细胞和增加肿瘤细胞对放射线敏感的双重功能。目前，在国外利用CDAIPRT融合基因治疗肿瘤的少量报道中，多使用大肠杆菌的CDAIPRT融合基因，而有多个研究表明，酵母菌CD基因较大肠杆菌CD基因的肿瘤治疗效果更好，因此本人推测酵母菌CD／UPRT融合基因较大肠杆菌的CD／UPRT融合基因治疗恶性肿瘤更有优势。 为此，本研究构建由Egr一基因启动子调控酵母菌自杀基因CDAIPRT融合基因表达的基因重组体pcDNA3二十)CMVEgr4．CD／UPRT进行鼻咽癌的基因一放射治疗研究。 该重组体的载体骨架来自质粒pCDNA3．1卜)CMV，此质粒载体仅有5．4kb，操作简单，其启动子来源于巨细胞病毒，能调控下游基因高效表达，同时质粒载体具有无免疫原性、安全性好、体内能携带目的基因稳定遗传的优点，由于本研究中所插入的自杀基因片段小于2．skb，因此，pCDNA3．l广)CMV质粒载体是本研究较为理想的选择。 重组体中的 Egr基因启动子通过 PCR方法从鼠 gDNA中克隆，经测序分析，－419至十26的序列与国外文献报道的一致。此外，本研究自质粒PEGFPNI启动子CMV中克隆了增强子，然后通过融合PCR方法构建了893hp的CMVEgrl融合启动子，最后克隆至载体内自杀基因上游，可以进一步增强Egrl基因启动子调控下游自杀基因的表达，达到提高鼻咽癌放射治疗效果的目的。 研究中，通过电穿孔法将构建的自杀基因质粒载体pCDNA3二 卜)CMVEgr刁．CD／UPRT导入鼻咽癌CNE毛细胞中，经G418正筛选和 5＊C的负筛选后，获得了稳定表达CDAfPRT基因的阳性克隆并扩大培养成系，最后通过RTPCR鉴定CD／UPRT基因在CNE《细胞中稳定表达。 3中南人学 博士学位论义 利用建立的表达自杀基因的鼻咽癌CNE－2 细胞系，本研究进行了CD／UPRT／5FC 自杀基因／前体药物系统对鼻咽癌CNE《细胞杀伤作用的体外kxOZOO)实验。结果表明：＊＊m＊RT乃fC自杀基因前体药物系统可以通过旁杀效应和促进细胞凋亡杀伤CNE－2细胞。 接着本研究利用CD／UPRT／5＊C自杀基因／前体药物系统进行鼻咽癌的原位OnSitS)基因治疗研究。除有1组不予脂质体包裹质粒瘤内注射外，余5组均以脂质体包裹质粒pcDNA3．l卜)CMVEgrl 注射至裸鼠鼻咽癌移植瘤内，除空白对照组之外相应地给予5FC和／或Y射线照射，结果发现与对照组比较，单纯前体药物组、单纯放射处理组以及放射联合前体药物处理组均能抑制裸鼠移植瘤生长（刃＊），各处理组裸鼠移植瘤组织病理切片、＊E染色发现鼻咽癌细胞散在或大片坏死红染，而对照组却没有出现明显坏死。 总之，本实验利用Egr一基因启动子调控酵母菌CD川PRT基因表达进行了鼻咽癌的基因一放射治疗实验研究，结果表明CD／UPRT基因在无毒前体药物5fC干预下可以杀伤鼻咽癌细胞和裸鼠鼻咽癌移植瘤，具有鼻咽癌