研究背景胆碱酯酶是一类以同工酶的形式存在于生物体内的糖蛋白。主要包括乙酰胆碱酯酶(Acetylcholinesterase,AChE)和丁酰胆碱酯酶(Butylcholinesterase,BChE)。AChE能够水解神经递质乙酰胆碱(Acetylcholine,ACh),但是BChE的生物学功能尚未被完全阐明。斑马鱼是重要的脊椎动物模型。已有研究鉴定了斑马鱼的AChE基因,斑马鱼虽具有BChE活性,但其BChE同源基因至今未明。斑马鱼未命名基因si:dkey-30c15.17、si:ch73-89b15.3在数据库中被预测具有胆碱酯酶结构域,但尚未被鉴定。因此对这两个基因胆碱酯酶活性的研究,对于鉴定出斑马鱼中编码BChE活性蛋白的基因并对其功能进行的研究能提供重要的理论基础与实验依据,对于完善整个胆碱酯酶基因家族的功能研究,也有重要意义。目的分析si:dkey-30c15.17、si:ch73-89b15.3这两个基因在斑马鱼中的表达图谱,探究其是否具有胆碱酯酶活性。内容1.斑马鱼BChE活性验证通过收集斑马鱼受精后早期发育不同时期(0、1、2、3、4、5、6 dpf)的胚胎以及斑马鱼成鱼组织(肠、肝、脑、精巢、卵巢、心、肾)的样本来测定BChE活性,进行BChE活性验证。2.斑马鱼中两个胆碱酯酶样基因表达谱分析通过RT-PCR的方法研究两个斑马鱼胆碱酯酶样基因si:dkey-30c15.17、si:ch73-89b15.3在斑马鱼早期胚胎发育过程中以及成鱼的各个组织中的表达分布情况。3.HEK293T细胞中过表达两个胆碱酯酶样基因及其胆碱酯酶活性检测构建斑马鱼两个胆碱酯酶样基因在真核细胞中的表达质粒,转染到HEK293T细胞,检测过表达细胞的胆碱酯酶活性。4.利用CRISPR/Cas9技术构建斑马鱼基因敲除突变体及其胆碱酯酶活性的检测针对斑马鱼两个胆碱酯酶样基因si:dkey-30c15.17、si:ch73-89b15.3,设计CRISPR/Cas9靶位点,体外制备gRNA和Cas9 mRNA,并通过显微注射的方法注射到斑马鱼胚胎,经过传代及筛选,筛选到斑马鱼基因敲除纯合突变体并检测其胆碱酯酶活性。结果1.在斑马鱼成鱼的肠、肝、脑等组织中均检测到了较高的BChE活性;在5 dpf的斑马鱼胚胎中,开始检测到明显的BChE活性,证实了斑马鱼存在BChE活性;2.在斑马鱼成鱼组织中,si:dkey-30c15.17和si:ch73-89b15.3主要在斑马鱼体内的肝、生殖腺、肾、脑组织中均具有明显表达;在斑马鱼胚胎中,si:dkey-30c15.17和si:ch73-89b15.3分别在2、5、6 dpf和5、6 dpf时期具有较高的表达量;3.斑马鱼胆碱酯酶样基因si:dkey-30c15.17、si:ch73-89b15.3在HEK293T细胞中过表达之后,在过表达后的细胞中没有检测到明显的BChE活性和AChE活性;4.利用 CRISPR/Cas9技术成功构建了斑马鱼基因si:dkey-30c15.17、si:ch73-89b15.3敲除的纯合突变体;突变体斑马鱼成鱼的各组织中,胆碱酯酶活性与野生型相比并无明显差异,提示si:dkey-30c15.17、si:ch73-89b15.3基因既不具有BChE活性也不具有AChE活性。结论:1.系统性得验证斑马鱼具有BChE活性,并且其在斑马鱼体内组织的表达分布跟人BChE蛋白在其体内组织的表达分布相似;2.两个新型的胆碱酯酶样基因si:dkey-30c15.17、si:ch73-89b15.3在斑马鱼体内首次被证实既不具有BChE活性也不具有AChE活性,不是编码斑马鱼BChE活性蛋白的基因。