[研究背景]骨肉瘤是最常见的骨骼系统原发的恶性肿瘤,在肿瘤的化学治疗尚未发明前,预后非常差。在骨肉瘤的化学治疗中,多药耐药的发生严重的影响了骨肉瘤化疗的效果和成功率。多药耐药是肿瘤细胞对相当多的拥有不同的结构或通过不同的靶点起相应作用的化疗药物表现出来的耐受性。人类多药耐药1(MDR1)编码一种镶嵌于细胞膜上的泵蛋白P-gp,它在肿瘤多药耐药过程中起到重要的作用。该蛋白表达的增多可以导致化疗药物从肿瘤细胞中外排增强,从而使细胞对于化疗药物表现出相当的抗性,特别是对于多柔比星和紫杉醇等。毛发-鼻-趾综合征基因1(TRPS1)是一个介导毛发-鼻-趾综合征(TRPS)的基因,该综合征具有特征性的软骨和骨骼的畸形。该基因编码一段含有9个锌指蛋白结构域的转录调节因子,它包含一个GATA盒的DNA结合位点的锌指蛋白。TRPS1已经在某些恶性肿瘤细胞中被发现并且可能在乳腺癌和前列腺癌中具有一定的提示意义。而且另有报道说TRPS1在小鼠成软骨细胞ATDC5中促进细胞凋亡和软骨的发生。在我们的前期研究中,我们发现TRPS1可以在小鼠的胚胎肾脏组织中抑TGFp-1的表达,并且抑制TGFβ的信号传导通路,而又有相关报道说明在人的脑部胶质瘤中TGFβ-1和TGFβ-2均可抑制MDR1基因的表达。因而TRPS1也有可能通过调控MDR1影响多药耐药。TRPS1在骨肉瘤中能否调节MDR1基因的表达从而影响多药耐药对于改善耐药骨肉瘤的预后有重要意义。我们前期在骨肉瘤临床样本的研究中观察到了MDR1和TRPS1具有一定的相关性。在MDR1基因的固有启动子区有三个预测到的可能于TRPS1结合的GATA盒相关序列。我们设想用携带TRPS1基因的siRNA的质粒干扰TRPS1基因的表达可能会导致P-gp糖蛋白的含量的降低,并因此可以部分的逆转肿瘤的耐药性。在此项研究中,为了明确TRPS1在骨肉瘤细胞中是否具有调节MDR1的作用,我们对三个经典的骨肉瘤细胞株进行TRPS1的影响,以期对两者在功能上的联系进行评价。我们在一定数量的骨肉瘤的临床样本通过免疫组化进一步预测TRPS1对于预测MDR1表达的意义。[研究方法]1.分别用Q-PCR及Western blot的方法检测3种骨肉瘤细胞系U2-OS,MNNG/HOS Cl#5以及Saos-2中TRPS1及MDRl基因的表达情况。2.收集临床未脱钙骨肉瘤石蜡切片标本进行TRPS1和MDR1的免疫组化染色,并进行统计分析两者之间的关联性。3.设计并合成针对TRPS1基因的双链干扰RNA序列以及非靶向性干扰序列作为阴性对照,将其定向插入到质粒载体pSUPER.neo+GFP中,构建稳定表达载体pSUPER-siTRPS1和pSUPER-siNC。购买了TRPS1全长克隆载体,酶切并连接于pcDNA3.1上,阴性对照序列同样连接于其上。测序结果正确后,大肠杆菌培养质粒扩增。4.上述质粒载体分别转染3种骨肉瘤细胞中,继续培养48小时后,通过Q-PCR检测各组细胞中TRPS1和MDR1mRNA的表达情况,Western blot检测TRPS1蛋白和P-gp的表达,应用加药MTT法检测各组细胞对多柔比星、顺铂等的半数细胞致死量(ICso)的改变,罗丹宁外排实验观察P-糖蛋白的外排功能改变,评价TRPS1调控MDR1对细胞多药耐药性的影响。5.采用U2-OS细胞并应用TRPS1抗体进行染色质免疫共沉淀实验,并以预测的MDR1启动子区结合位点特异性设计引物,将共沉淀所得的CDNA片段进行相应扩增,验证是否有相应的结合位点。6.对U2-OS细胞转染了TRPS1相应质粒的细胞系进行TFGbetal的mRNA和蛋白的检测,以观察其可能对TGFβ信号转导通路的影响。[实验结果]1.对3种经典骨肉瘤细胞系检测发现TRPS1在U2-OS,MNNG/HOS Cl#5中表达量较高,在Saos-2细胞株中表达量较少,MDR1在前两种细胞中表达,而在Saos-2中检测不到蛋白表达。2.对临床收集的74例无脱钙液处理的骨肉瘤样本中,用免疫组织化学染色检测TRPS1为32.4%(24/74),MDRl阳性率为16.2%(12/74),经过分析二者Pearson相关系数为0.478,呈中度相关性且有显著意义P<0.01,在9例骨样骨瘤标本中两者均为阴性。3.三种细胞系经转染TRPS1干扰和全长质粒后于其相应的阴性对照组检测发现,TRPS1及MDR1mRNA和蛋白水平均呈显著变化,且两者变化趋势一致。4.转染48h后,MDR1功能性试验均有明显的差异性。用MTT实验检测细胞对4种化疗药的耐受性程度,TRPS1干扰组对多柔比星、顺铂、紫杉醇和5-氟尿嘧啶的耐受性显著下降,半数致死量减低,而TRPS1过表达组则呈现相反趋势。在罗丹宁外排检测中,TRPS1干扰组中罗丹明荧光含量均显著高于对应的阴性对照组,荧光强度曲线右移,P-糖蛋白泵出功能降低。过表达组同样趋势相反。5.对U2-OS细胞株中进行的CHIP实验发现在其MDR1基因启动子区域内具有TRPS1转录因子蛋白的结合,并且检测到相应的TRPS1表达质粒转染后细胞中TGFp-1分子的表达受到了抑制。[结论]1. TRPS1与MDRl在骨肉瘤细胞及组织中均有一定表达且呈现一定相关性,提示TRPS1可能通过调控MDR1的表达间接影响骨肉瘤的多药耐药。干扰或过表达TRPS1可以抑制或促进MDR1的表达,从而影响细胞对化疗药物的耐受性。提示TRPS1有可能并有望成为潜在的预测骨肉瘤耐药性的指标及逆转多药耐药的靶点。2. TRPS1被证实结合与骨肉瘤细胞MDR1的启动子区提示可能有TRPS1复合体直接参与MDRl转录的调控。3. TRPS1抑制骨肉瘤细胞TGFβ-1分子的表达。