论文部分内容阅读
目的:糖尿病肾病是一种较常见的糖尿病并发症,其特有的病理生理学改变提高了麻醉风险,越来越受到临床麻醉医生的重视。右美托咪定作为α2-肾上腺素受体激动剂,具有较稳定的镇静、镇痛作用,且对急性肾损伤和肾缺血再灌注损伤具有保护作用。糖尿病患者体内长期处于高血糖状态,可导致组织和细胞氧化应激损伤,进而引起肾小管上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT),其与肾间质纤维化关系密切,严重影响肾脏功能。本研究利用体外细胞实验和体内动物实验,探讨右美托咪定对糖尿病肾病的保护作用及其相关机制,旨在为糖尿病肾病的麻醉药物选择提供可靠的理论依据,并为糖尿病肾病的临床麻醉管理提供一定的指导作用。方法:1.体外建立高糖对人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤模型,加入不同浓度(0 m M、10 m M、20 m M、30 m M、40 m M、50 m M、60 m M)葡萄糖处理HK-2细胞6 h,通过CCK-8法检测不同浓度各组细胞存活率,利用倒置显微镜镜下观察不同浓度葡萄糖各组细胞形态学改变,通过Western blotting法检测不同浓度各组细胞AKT、磷酸化AKT(p-AKT)、ERK、磷酸化ERK(p-ERK)及EMT相关蛋白(E-Cadherin、α-SMA和Claudin-1)表达。2.通过CCK-8法检测不同浓度右美托咪定各组细胞存活率确定其作用浓度和时间,体外实验分为三组:正常对照组(Normal组)、高糖损伤组(Glu组)、高糖损伤+右美托咪定组(Glu+Dex组)。HE染色检测上述三组细胞形态学改变,荧光探针法检测上述三组细胞内活性氧水平,流式细胞术检测上述三组细胞周期进程,流式细胞术Annexin-V/PE法检测上述三组细胞凋亡水平,Western blotting法检测上述三组AKT、p-AKT、ERK、p-ERK及EMT相关蛋白(E-Cadherin、α-SMA和Claudin-1)表达情况。加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002和ERK通路抑制剂U0126,Western blotting检测上述三组AKT、p-AKT、ERK、p-ERK及EMT相关蛋白(E-Cadherin、α-SMA和Claudin-1)表达情况3.体内建立兔糖尿病肾病模型,体内实验分为三组:正常对照组(Control组)、糖尿病肾病组(DN组)、糖尿病肾病右美托咪定组(DN+Dex组),每组6只,右美托咪定按50μg/Kg给予糖尿病肾病兔处理6 h。检测上述三组组兔一般指标包括血糖、体重、肾重/体重、尿蛋白,光镜下观察结合HE染色检测上述三组肾组织损伤的病理学改变,Western blotting法检测上述三组AKT、p-AKT、ERK、p-ERK及EMT相关蛋白(E-Cadherin、α-SMA和Claudin-1)表达情况。结果:1.体外建立高糖对人肾小管上皮细胞(HK-2细胞)损伤模型(1)随着葡萄糖处理浓度的增加,HK-2细胞存活率逐渐下降。(2)随着葡萄糖处理浓度的增加,细胞形状由近似圆形逐渐变为长梭形,且细胞间隙变大,贴壁细胞减少,生长状态变差。(3)随着葡萄糖处理浓度的增加,HK-2细胞总蛋白AKT表达下降,ERK、p-AKT和p-ERK表达上调,p-AKT/AKT和p-ERK/ERK比值明显升高,EMT相关蛋白α-SMA表达明显上调,E-Cadherin和Claudin-1表达明显下调。2.右美托咪定减轻高糖对人肾小管上皮细胞EMT。(1)随着Dex浓度降低,HK-2细胞存活率升高,最终选择0.01nM处理6 h。(2)HE染色结果显示,Glu组细胞正常形态明显改变,细胞体积变大,存活细胞数目减少,Glu+Dex组和Normal组细胞形态良好。(3)荧光探针CM-H2DCFDA检测各组细胞内ROS水平,Glu组荧光强度明显高于Glu+Dex组和Normal组,差异具有统计学意义。(4)通过流式细胞术Annexin V/PE法检测各组细胞凋亡情况,和Glu组相比,Glu+Dex组和Normal组细胞凋亡率明显低于Glu组,差异具有统计学意义。(5)通过流式细胞术检测各组细胞周期的分布,和Glu组相比,Glu+Dex组和Normal组细胞数G1期较多,G2期细胞数较少,差异均具有统计学意义。(6)通过Western blotting检测各组细胞相关蛋白表达情况,与Glu组相比,Glu+Dex组和Normal组PI3K表达升高,AKT表达升高,p-AKT表达降低,p-AKT/AKT比值下降,ERK表达降低,p-ERK表达降低,p-ERK/ERK比值下降,差异均具有统计学意义。(7)加入PI3K/AKT通路抑制剂LY294002和ERK通路抑制剂U0126检测相关蛋白表达,抑制剂Glu+LY294002组p-AKT和p-ERK下降均明显,Glu+U0126组p-ERK下降明显但p-AKT下降不明显,Glu+LY294002组和Glu+U0126组和其他组相比,E-Cadherin和Claudin-1表达上升、α-SMA表达下降,差异均具有统计学意义。3.右美托咪定对兔糖尿病肾病上皮间质转化具有保护作用。(1)和Control组相比,DN组和DN+Dex组血糖升高,体重明显降低,肾重/体重比值尿白蛋白明显升高,差异均具有统计学意义;与DN组相比,DN+Dex组血糖较低,体重较高,肾重/体重较低,尿白蛋白较低。(2)和Control组相比,DN组和DN+Dex组肾小球毛细血管袢面积升高,肾小球系膜及基底膜相对面积升高,差异均具有统计学意义;和DN组相比,DN+Dex组上述两个指标相对较低。(3)HE染色结果显示,和Control组相比,DN组肾小球系膜基质明显增多,肾小球内细胞明显增多;和DN组相比,DN+Dex组上述两个指标相对减少。(4)和Control组、DN+Dex组相比,DN组p-AKT和p-ERK表达升高,E-Cadherin和Claudin-1表达下降、α-SMA表达升高,差异均具有统计学意义。结论:1.高糖可使人肾小管上皮细胞p-AKT、p-ERK表达升高,E-Cadherin和Claudin-1表达降低,α-SMA表达增加,引起细胞上皮-间质转化。2.右美托咪定通过AKT和ERK上调E-Cadherin和Claudin-1表达及下调α-SMA表达,减轻人肾小管上皮细胞上皮-间质转化。3.右美托咪定对兔糖尿病肾病上皮-间质转化具有保护作用。