背景及目的鼻咽癌作为发源自鼻咽上皮细胞等方面存在的恶性肿瘤,实际的发病率存在显著的地域分布特性,而在东南亚以及我国的南方区域存在较高的产生几率,年发病比例约为20～30/10万。参照国际机构的统计属于,2008年出现的鼻咽癌病患数量大于84,000人,而有80%的患者位于亚洲,5%的患者位于欧洲。根据病因学的相关分析,鼻咽癌的产生和EB感染、种族、饮食以及环境等要素存在密切的联系。当前,伴随影像、放疗的发展以及联合放化疗的具体运用,从而令局部病灶获得更为理想的控制。但是,大部分鼻咽癌病患在首次诊断的时候就已经是晚期,最终的治疗效果未能实现理想的效果,Ⅲ期和Ⅳ期病患在5年生存率方面依次属于53%～80%、28%～61%。所以,怎样更好认知肿瘤产生的分子机制,进而探寻新的特异性治疗靶点,对于鼻咽癌的初期诊疗活动、个体治疗以及预后等方面显得极为关键。食管癌相关基因 4(esophageal cancer related gene 4,ECRG4)作为依靠相关的mRNA差异显示技术,而在高癌家族以及正常食管方面分离的差异序列,作为存在一定抑癌潜能的特殊基因。在大部分组织中都存在一定的表达,涵盖心、脑、肝、肺以及骨骼等区域。分析得出ECRG4加入到中枢神经的发育以及损失等相关反应,同时实现软骨细胞分化、软骨破坏以及细胞老化等多个方面的生理以及病理效应。而近些年的分析得出,这一基因在各类肿瘤方面存在下调表达,诸如食管鳞癌等,因此推定该基因相关的表达缺失,或许为加入到肿瘤演变的重要原因。当前针对ECRG4所进行的分析仅仅限制在少数恶性肿瘤的范畴,同时相关的调控机制也要求开展较为深入的分析。启动子高甲基化作为ECRG4实际存在的低表达以及转录失活等方面的核心原因。Gotze等在分析中提出,对于结肠癌和胶质瘤而言,ECRG4启动子区的相关甲基化有着较高频率的产生,代表着ECRG4在癌症组织方面的下调状况,和实际的甲基化状态存在紧密的联系。而且,采用相关的甲基化药物来开展处理操作之后,ECRG4在肿瘤方面存在的表达效应能够有效的恢复。有相关分析得出,从而使得ECRG4基因进一步转染至食管癌细胞方面,其可以有效的抑制其存在的增殖以及克隆形成效应,ECRG4实际存在的过表达导致细胞周期停滞于Gl期。使得ECRG4于头颈部肿瘤M2方面存在对应的过表达变化,进而得出其中的过表达能够大幅下降细胞存在的增殖以及侵袭能力。Matsuzaki等依靠过表达ECRG4的分析,得出其和Ki-67基因存在对应的负相关性,代表着ECRG4基因可以有效抑制细胞存在的增殖效应。在本研究中,我们分别应用RT-PCR以及Western-blot方法识别ECRG4在鼻咽癌组织以及细胞系等方面的mRNA与蛋白表达状态;通过免疫组化研究ECRG4在鼻咽癌方面的表达状态以及统计学要素,同时明确和临床病理的具体联系;建立ECRG4过表达脂质体,使用transwell以及裸鼠尾实验来明确ECRG4对细胞系5-8F、CNE2相关侵袭以及转移所构成的基础影响;Western blot研究ECRG4对于转移表达存在的基础影响;进一步使用RT-PCR以及明胶酶谱法来研究MMP2的mRNA表达以及酶活性;调整MMP2的表达,transwell观察MMP2对于ECRG4控制侵袭转移的基础影响;Western blot研究NF-kB p65的磷酸化状态;进行增殖以及克隆等实验,同时明确裸鼠身体中的成瘤实验ECRG4对于增殖能力所构成的基础影响;使用流式细胞仪的方案研究ECRG4对细胞周期所存在的影响;Western blot研究ECRG4对于配套调控蛋白所产生的基础影响。课题包含以下三个部分:第一部分:ECRG4在鼻咽癌组织和细胞中的表达及意义;第二部分:ECRG4通过NF-kB下调MMP2的表达抑制鼻咽癌的侵袭和转移;第三部分:ECRG4抑制鼻咽癌细胞的增殖第一部分ECRG4在鼻咽癌组织和细胞中的表达及意义1.培养3个人鼻咽癌细胞系(5-8F、6-10B、CNE2)和1个永生化鼻咽上皮细胞系(NP69)。2.收集河南省人民医院及郑大一附院2006年至2012年切除的鼻咽癌组织及正常鼻咽组织石蜡标本。3.采用免疫组化的方法检测鼻咽癌组织及正常鼻咽组织的ECRG4的表达。4.收集2例活检的鼻咽癌新鲜组织及7例正常鼻咽组织。5.采用Western blot和RT-PCR检测鼻咽癌新鲜组织及正常鼻咽组织的ECRG4的表达水平。结果:1、ECRG4在鼻咽癌组织中的表达明显低于癌旁组织针对2例活检癌变组织和7例健康组织进行对比分析,研究其中的蛋白以及mRNA水平的ECRG4表达状态,最终得出不管是在mRNA或蛋白水平中,ECRG4于鼻咽癌组织方面的表达都明显低于正常的组织。2、ECRG4在鼻咽癌细胞系中的表达Western-Blot以及RT-PCR分析得出,ECRG4实际检测的3种癌变细胞6-10B、CNE2中都存在一定的表达,实际的表达量都低于永生化的上皮细胞系,同时得出存在高转移特征的5-8F细胞系,在实际的表达水平方面显著低于不转移性以及低转移性的CNE2细胞系。3、ECRG4在鼻咽癌组织中表达的临床病理学意义为有效分析ECRG4于鼻咽癌、正常组织之中存在的表达差异,笔者在分析环节中扩充样本规模,整理153例鼻咽癌以及3 0例非癌石蜡组织开展配套的检查工作,最终得出ECRG4于鼻咽癌方面集中于胞浆,较少的存在于胞核的位置。深入分析可得出ECRG4于非癌组织的高表达数量为2 8例(93.3%),低表达的数量为2例(6.7%),而对于鼻咽癌方面而言,构成高表达的数量为81例(52.9%),构成低表达的数量为72例(47.1%),两类组织的表达状况存在显著的区别,同时其中的区别存在显著的统计学意义(P<0.001)。4、ECRG4在鼻咽癌组织中表达的临床病理学意义深入探讨ECRG4于鼻咽癌方面的实际表达状况和临床病理学特征的基础联系时得出,ECRG4的实际表达状态和病患实际的性别、年龄以及抽烟等并不存在显著的联系。而ECRG4表达强度和EB、浸润、分化、TNM分期和转移等存在密切的联系。即存在EB病毒感染问题的病患,在ECRG4阳性表达率方面低于无EB感染的群体;而伴随实际肿瘤分化度提升的同时,ECRG4表达率会相对更高;而在肿瘤分期较晚的情况下,ECRG4表达率则会相对更低;存在远处及淋巴结转移的实际阳性率显著低于不存在转移问题的群体,而两个组别的数据差异存在一定的统计学价值,p<0.01。Kaplan-Meier生存期研究得出ECRG4实际的表达状况和病患的预后存在紧密的联系,ECRG4低表达的病患,在各种生存期参数上都显著低于ECRG4高表达的群体。第二部分:ECRG4通过N F-k B下调MMP2的表达抑制鼻咽癌的侵袭和转移方法:1、ECRG4-pcDNA3.1 载体的构建。2、构建ECRG4、MMP2过表达载体。3、构建稳定转染pcDNA3.1载体的鼻咽癌细胞系。4、Transwell小室实验测定5-8F、CNE2细胞和相关对照细胞具体的迁移与侵袭表现。5、通过SPSS 13.0围绕分析获得的数据开展分析活动,同时以平均值±标准差的模式来展示。采用相关的配对样本t检验来判断其中的具体差异。若是p<0.05,那么认定其中的组间差异存在一定的统计学价值。结果:1、将p3.1/ECRG4-pcDNA3.11、p3.1/ECRG4-pcDNA3.12 和 p3.1 空载体转染鼻咽癌5-8F以及CNE2细胞系,通过G418而开展配套的阳性克隆筛选工作,进一步得到可实现稳定转染效果的对应6株细胞系,将其名称依次界定为5-8F/pcDNA3.11、5-8F/pcDNA3.12、5-8F/control、CNE2/pcDNA3.11、CNE2/pcDNA3.12以及CNE2/control。成功构建了稳定转染pcDNA3.1载体的鼻咽癌细胞系。2、上调ECRG4的表达抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭能力与转染 p3.1 空载体细胞相比,ECRG4-pcDNA3.1l、ECRG4-pcDNA3.12 转染造成5-8F细胞方面的迁移细胞数依次降低78.3%与65.1%,而关于其中的侵袭细胞实际的降低比例则属于70.4%以及59.8%。进而令CNE2细胞实际的迁移细胞数降低82.5%以及52.7%,而侵袭细胞数的减少幅度属于76.9%以及69.4%。体外迁移以及相关的侵袭实验得出,上调细胞中的ECRG4表达可以有效的抑制鼻咽癌细胞所存在的基础迁移以及侵袭效应,代表着ECRG4或许具备抑制癌细胞侵袭效应的对应能力。3、ECRG4影响鼻咽癌细胞内转移相关基因的表达为有效的论述ECRG4怎样控制鼻咽癌细胞方面存在的迁移以及侵袭效应。在分析中采用Western blot来测定转移相关基因,探寻ECRG4潜在的相关靶基因。而在大量的和肿瘤转移存在联系的基因中,实际选定了曾报道为属于ECRG4基础裂解底物的MMP2、MMP9、Snail、P-catenin和VimentinE-cadherin,、N-cadherin,最终得出上调ECRG4的表达,能够控制鼻咽癌MMP2、Snail以及Vimentin的表达,体会E-cadherin的对应表达,同时MMP9、N-cadherin以及P-catenin在表达水平上并不存在显著的变化。4、上调ECRG4的表达降低鼻咽癌细胞内MMP2的表达水平及其酶活性细胞外基质降解作为相关的肿瘤细胞对于周边存在浸润,以及对于远处存在侵袭、转移等变化的必要基础,当前众多的分析得出基质金属蛋白酶MMPs和转移之间存在极为紧密的联系,例如MMP2于多类肿瘤转移之中起到一定的重要影响,尤其是MMP2也加入到鼻咽癌转移效应中。最新的分析得出ECRG4可下调MMP2的表达,进而抑制相关肝内胆管细胞癌所存在的转移变化。所以综合前文中Western blot的对应结果,推测ECRG4影响转移或许涉及MMP2的调节效应。针对该问题,使用RT-PCR在5-8F、CNE2两个细胞系方面再度验证上调ECRG4表达可导致MMP2表达的下降。进而依靠配套的明胶酶谱法而识别MMP2的酶活性状态。最终得出于5-8F、CNE2两个细胞系之中进行上调ECRG4的活动,都会导致MMP2酶活性的显著下降。5、ECRG4抑制鼻咽癌细胞的迁移和侵袭是通过下调MMP2的表达为判断ECRG4可否利用诱导MMP2表达而控制鼻咽癌细胞方面存在的迁移以及侵袭的变化,先是通过siRNA技术来下调表达,随后研究细胞所存在的迁移以及侵袭表现,分析得出:下调MMP2的表达会导致5-8F、CNE2细胞实际的迁移以及侵袭能力存在显著的降低,同时其中的降低幅度和ECRG4-pcDNA3.1细胞较为接近,实际存在的区别并不存在统计学价值。最后以上调鼻咽癌细胞之中ECRG4表达作为基础,进而过表达MMP2,以此来研究实际的迁移以及侵袭能力,最终得出:在5-8F、CNE2细胞系方面针对MMP2采取外源过表达,都可以恢复ECRG4-pcDNA3.1所导致的迁移以及侵袭能力的降低。前述分析得出ECRG4对于迁移以及侵袭所构成的影响,或许是依靠下调MMP2表达而实现的。6、ECRG4调节MMP2的表达是通过NF-kB的活化来完成相关西得出,肝细胞癌方面的NF-kB是ECRG4促细胞转移对应的下游效应分子,除此之外,在以往的多方面分析活动中得出NF-kB可上调MMP2的表达进而加速肿瘤细胞所存在的转移变化。所以设想ECRG4于鼻咽癌细胞系方面下调MMP2表达的变化,有没有涉及活化NF-kB的效应。Western blotting分析得出siRNA knockdown ECRG4 后能显著降低细胞内NF-kB p65的磷酸化;与之相反的,外源性的过表达ECRG4后可加速NF-kB p65所存在的磷酸化。最后采用相关的NF-kB抑制剂helenalin来抑制NF-kB所存在的活性,从而识别细胞中MMP2具体的表达变化。对于过表达或knockdown细胞中存在的ECRG4,采用helenalin抑制剂之后,MMP2的实际表达状态和对照细胞进行对比,都存在着显著的降低,最终的结果得出抑制NF-kB活性可有效抑制ECRG4针对MMP2表达所存在的诱导效应。这些结果提示ECRG4下调MMP2的表达可能是通过NF-kB p65的磷酸化。第三部分ECRG4抑制鼻咽癌细胞的增殖方法:1、细胞生长曲线的测定(CCK8实验)。2、细胞平板集落形成实验3、流式细胞仪分析细胞周期4、裸鼠体内成瘤实验结果:1、上调ECRG4抑制细胞增殖标志蛋白PCNA的表达2、上调ECRG4的表达显著降低鼻咽癌细胞的体外增殖能力3、上调ECRG4的表达显著地抑制鼻咽癌细胞克隆形成能力4、上调ECRG4表达抑制鼻咽癌细胞体内成瘤能力5、ECRG4可阻止鼻咽癌细胞由G1期向S期进展6、ECRG4 通过下调 Cyclin D1、Cyclin D2 和 Cyclin E,上调 p27 发挥作用。结论:1、发现ECRG4在鼻咽癌组织的表达明显低于正常鼻咽组织;发现ECRG4在鼻咽癌组织中的表达水平与EB病毒的感染、组织的分化程度、TNM分期、肿瘤的体积和转移相关;2、发现上调ECRG4的表达可以明显抑制鼻咽癌细胞转移、侵袭、增殖和成瘤能力;3、ECRG4抑制鼻咽癌细胞的转移、侵袭,可能是通过依赖NF-kB信号通路下调MMP2的表达来实现;4、上调ECRG4的表达可以阻止鼻咽癌细胞由G1期向S期进展,使细胞停滞于G0/1期,其潜在的机制可能是部分通过下调Cyclin D1、Cyclin D2和Cyclin E,上调p27来实现。5、上调ECRG4的表达抑制鼻咽癌细胞的体内转移能力为进一步研究ECRG4对鼻咽癌细胞体内转移能力的影响,我们选择体外实验显示抑制能力较强的5-8F/pcDNA3.11细胞和其对照细胞分别通过尾静脉注射到裸鼠体内,结果表明注射5-8F/pcDNA3.11细胞的裸鼠体内较少形成转移灶,10只裸鼠只有1只发生肝转移,2只发生肺转移,而注射对照组细胞5-8F/control的10只裸鼠出现肺脏和肝脏转移均为7只,这一结果提示ECRG4有抑制鼻咽癌细胞在裸鼠体内脏器转移的作用。