目的报道1株伴有t（16;17）（q24;q12）所致衍生16号染色体为特征的髓系白血病细胞系的建立及其生物学特征的初步鉴定。方法与结果1、病例资料SH-2细胞系来自初诊时1例35岁男性AML-M_2a患者骨髓,该患者对多种化疗药物耐药,于接受异基因半相合外周血造血干细胞移植后1月余死于白血病复发。2、细胞系的建立应用淋巴细胞分离液梯度密度离心法常规分离骨髓单个核细胞,以含20%胎牛血清的IMDM培养基调整细胞密度为2*10⁶/ml,接种于25cm²培养瓶中,置37℃、5%CO₂、饱和湿度培养箱中培养,每3～4d 2/3～半量换液1次,约一周后瓶底出现贴壁黏附的基质细胞,每次换液保留部分贴壁基质细胞与悬浮的白血病细胞共培养,并调整细胞密度为（0.2～1） *10⁶/ml。约一个月后培养细胞出现缓慢增殖,在培养基中加入细胞因子10ug/ml的rh-IL-3,3个月后增殖速度有所增快,4个月后培养体系中撤去rh-IL-3,每3d继续2/3换液1次。目前已在体外培养22月,能耐受冻存和复苏,命名为SH-2。3、SH-2细胞的形态学特征及组化染色SH-2细胞在瑞氏染色下呈中等大小,大多为圆形和类圆形,胞核圆形,少数胞核可见轻度凹陷,核染色质呈细致,部分可见核仁,胞浆量中等,染灰蓝色,部分细胞胞浆中可见少量紫红色嗜天青颗粒。POX染色58%为阳性。α-醋酸萘酚酯酶染色39%为阳性,不被氟化钠抑制。糖原染色18%阳性。4、SH-2细胞的超微结构特征透射电镜下SH-2细胞呈圆或椭圆形,细胞表面有短小微绒毛,细胞质内可见丰富的细胞器如:线粒体、内质网、糖原颗粒和溶酶体颗粒,核型不规则,部分细胞可见核仁。5、SH-2细胞的免疫表型FCM检测显示SH-2细胞主要表达髓系、NK系抗原,也有部分T淋系的标志。其中CD13、CD33、CD38、CD117、CD7、CD56、CD25、CD16/56和MPO阳性,而T系抗原CD2、CD3、CD4、CD5阴性;B系抗原CD10、CD19、CD20、CD22阴性:单核细胞系抗原CD14阴性;巨核系CD41、CD61、CD42b阴性;另外CD34、MDR1表达阴性:嗜碱粒细胞标记CD203阴性。6、SH-2细胞的细胞和分子遗传学特征患者2005年6月23日原代骨髓细胞核型分析结果提示45,X,-Y,der（16）t（16;17）（q24;q12）,-17,+19[18]。高剂量化疗一疗程后核型为45,X,-Y,der（16）t（16;17）,-17,+19[21]/78,der（16）t（16;17）[1]。2006-2-15（培养5个多月）细胞系核型分析结果为:45,X,-Y,der（16）t（16;17）（q24;q12）,-17,+19[5]/45,X,-Y,del（4）（q2 ? 6）、der（16）t（16;17）（q24;q12）,-17,+19[2]/69～105,含der（16）t（16;17）×2[15]。培养22个月SH-2核型分析:染色体数目分别为73,75,75,76,76,77,77,78,79,79,81,81,82,85,88,92,94,100,101,102,核型为:73-102（80）,XX,-Y,-Y,del（1q31）×2,der（16）t（16;17）（q24:q12）×2,-17,-17,+19,+19[20]。应用16号和17号整条染色体涂抹探针进行染色体涂抹,结果显示:1条16号和1条17号染色体分别呈现整条红色和整条绿色的荧光信号,提示为正常的16和17号染色体,1条16号染色体呈现大的红色荧光信号和小的绿色荧光信号并存,证实16和17号染色体之间发生了不平衡易位,形成衍生16号染色体同时丢失了一条17号染色体。染色体涂抹检测19号染色体三体显示:分裂相中有3条整条呈绿色荧光信号的染色体,提示为三体19号染色体。FISH检测PML/RARα融合基因:所有分析的中期和间期细胞均显示分离的双红双绿荧光信号,未见PML-RARα融合信号,表明该例的t（16;17）易位未涉及RARα基因。16和17号染色体断裂位点定位:（1）FISH检测CBFβ基因:在同一条16号染色体上可见二个黄色荧光信号（CBFβ）靠近二个红色荧光信号（16号着丝粒）,提示衍生16号染色体的长臂断裂位点位于CBFβ所在的位点16q22以下。（2）FISH检测RARα基因:采用16号着丝粒（红色信号）加RARα双色（红绿融合信号）,一条染色体显示红色荧光信号提示为正常16号染色体:1条染色体显示红绿融合信号提示正常的17号染色体;另1条染色体中间呈红色信号而另一端呈红绿融合信号,提示为16和17号染色体易位所致的衍生16号染色体,并且表明17号染色体断裂位点位于RARα基因的上方。（3）FISH检测16q断裂点:同时应用16号着丝粒探针（红色）和一条16q亚端粒探针（绿色）进行双色FISH检测,结果显示:一条较小的染色体上同时呈现一个红色信号以及一个小的绿色信号提示为正常的16号染色体,另一条衍生16号染色体中间可见一个红色信号而在长臂中段可见绿色信号,提示16号染色体的断裂位点位于q24。17号上p53探针检测显示SH-2细胞中期相一条17号染色体上存在2个绿色荧光信号为p53信号,而另一条17号染色体缺失。PCR扩增p53基因5、6、7和8号外显子所得产物经序列分析发现有p53基因的5号外显子存在突变,自p53基因起动子开始的第576号碱基G→T,密码子CAG→CAT,相应编码的氨基酸在192位处由谷氨酸→组氨酸。多色FISH:产用Vysis Spectra Vysion ^TMM-FISH探针试剂盒,应用5种荧光素SpectrumGold、SpectrumFred、SpectrumAqua、SpectrumRed和SpectrumGreen按缺口平移法对每一种染色体进行不同的组合标记,制备成探针池,均显示一条16号染色体长臂末端有来源于17号染色体的片段,三条19号染色体,Y染色体缺失。检测结果证实了染色体核型分析结果。7、SH-2细胞集落形成能力半固体甲基纤维素集落培养证明SH-2细胞具有一定的集落形成能力,用含25%FBS的半固体培养基,接种细胞数为0.5×10⁵/ml,培养12天见白血病集落。8、EB病毒和支原体检测荧光定量PCR未检出EB病毒DNA。SH-2细胞的培养上清经DNA巢式RT-PCR法未检测到支原体以及衣原体污染。9、各种细胞因子对SH-2细胞的增殖效应在SH-2培养细胞体系,分别加入各种细胞因子,其中GM-CSF、IL-3、IL-6、SCF、IL-4和IL-5促进SH-2细胞增殖,而TPO、TNF-α、IFN-α、LIF、Flt3-L等则无刺激SH-2细胞增殖的作用。10、SH-2细胞的多药耐药研究MTT药敏法观察SH-2细胞对VP16、紫杉醇、柔红霉素、米托蒽醌、高三尖杉酯碱和阿糖胞苷的敏感性。采用FCM检测MDR1表达,结果显示MDR1为低表达。11、短串联重复序列（STR）检测比较患者初诊时、移植后骨髓单个核细胞和体外培养后3个月、6个月以及培养后1年的细胞系,选取D3S1358、vWA、FGA、X/Y、D8S1179、D21S11、D18S51、D5S818、D13S317和D7S820等10个STR位点。结果分析采用Genescan 3.1系统。患者初诊时染色体核型分析显示除45,X,-Y,der（16）t（16;17）（q24:q12）,-17,+19外还存在少量正常核型的细胞,长期培养的SH-2细胞系染色体分析仅见包括Y染色体缺失在内的异常核型的细胞,因此在SH-2细胞系STR检测分析结果尽见X染色体信号,而无Y染色体信号,D8S1179、D21S11、D18S51等九个STR位点基因型与受体原来的信号相一致,证明SH-2细胞系与患者基因型为同一来源,排除了细胞系之间污染的可能。12、致瘤性8只裸鼠皮下接种SH-2细胞8周,5只裸鼠皮下观察到实体瘤生成。肿瘤组织石蜡病理切片,经HE染色后镜下观察可见多由白血病细胞组成。取肿瘤组织磨碎后推片,瑞氏染色后镜下所见细胞形态保持原有的粒细胞特征;另外肿瘤细胞的细胞免疫表型表达人白细胞抗原CD45为98.56%阳性,其他标志与培养的细胞系完全一致。从实体瘤取出细胞进行核型分析:染色体数目分别为:94=292=5 91=1 90=1 89=2 88=1 87=2 83=1 82=1 81=1 77=3。核型为近四倍体（77～94）,XX,-Y,-Y,1q-×2,+1,der（16）t（16;17）×2,-17,-17,+19,+19[20]13、t（16;17）（q24;q12）断裂点的精确定位,通过BAC系列探针,确定16号染色体断裂点位于克隆RP11-356C4（16q24.3）内部或其端粒侧;17号染色体断裂点位于克隆RP1-161P9与RP11-47L3之间（17q12）。结论我们建立了一个具有t（16;17）（q24;q12）不平衡易位的急性髓系白血病细胞系。t（16;17）（q24;q12）是一种新的罕见的髓系白血病相关染色体易位,可能提示预后不良。具有t（16;17）（q24;q12）不平衡易位的白血病细胞系SH-2细胞主要表达髓系、NK系抗原。建系初期核型为:45,X,-Y,der（16）t（16;17）,-17,+19;培养22个月后全部转为包括2个t（16;17）易位所致衍生16号染色体在内的近四倍体核型。衍生16号染色体的长臂断裂位点位于CBFβ所在的位点16q22以下,定位于16q24.3上克隆RP11-356C4（16q24）内部或其端粒侧;17号染色体断裂位点位于RARα基因的上方,定位于17q12上克隆RP1-161P9与RP11-47L3之间（17q12）。IL-3、IL-6、SCF、GM-CSF、IL-4和IL-5可明显促进SH-2细胞的增殖。SH-2细胞在具有集落形成能力和裸鼠内致瘤能力。EB病毒及支原体与衣原体检测阴性。MDR1为低表达。SH-2细胞存在p53基因5号外显子突变,自p53基因起动子开始的第576号碱基G→T,密码子CAG→CAT,相应编码的氨基酸在192位处由谷氨酸→组氨酸。我们的研究为白血病的体内外研究提供了又一个具有明晰生物学背景的有用工具,同时为进一步克隆t（16;17）（q24:q12）易位所产生的融合基因奠定了基础。