小菜蛾(Plutella xylostella)(鳞翅目:菜蛾科)是十字花科蔬菜的主要害虫,在农业生产中每年都造成严重损失。由于长期使用化学控制方法,加上大量和不合理使用杀虫剂,小菜蛾对多种杀虫剂产生了抗药性,已成为世界上高抗药性的害虫之一。因此生物防治技术的发展已成为控制小菜蛾的必然趋势。昆虫主要依靠先天免疫系统防御病原微生物的入侵,如果昆虫失去天然免疫的保护,则会影响其生存。使用昆虫病原真菌及其产生毒力因子可用来生物防治害虫。分析宿主昆虫对病原真菌的免疫防御机制,可以为昆虫病原真菌防治害虫提供理论依据和可能的目标。Micro RNAs(miRNAs),是一组长度为19-24 nt的非编码RNAs,通过转录后调控来降解m RNA或阻断其翻译,来调节许多生物学过程,包括发育、代谢、行为、变态和免疫。本研究以小菜蛾作为研究对象,对蝉拟青霉诱导后小菜蛾的小RNA进行测序,并对miRNA进行鉴定,分析差异表达的miRNA,预测miRNA免疫相关靶基因。分析了Toll通路免疫基因微生物诱导前后的表达情况。通过RNAi的方法探讨了pxy-miR-8523＿1ss16TG对小菜蛾xSpz5基因的表达调控功能。主要研究结果如下:1.对蝉拟青霉诱导小菜蛾幼虫(IL)及未诱导幼虫(NL)miRNA进行高通量测序。鉴定出432个小菜蛾miRNA,其中已知miRNA 248个,新发现184个miRNA。显著差异表达的(p<0.05)miRNA有32个。RT-q PCR检测结果表明bmo-miR-13b-3p和PC-5p-282993＿8在细菌和真菌的诱导下表达量均显著比对照高。而bmo-miR-14-3p＿R+1、pxy-miR-8523＿1ss16TG和bmo-miR-1a-3p 3个miRNA在不同的微生物的诱导下的表达量都显著低于对照组。2.预测的小菜蛾miRNA免疫相关靶基因主要包括Toll通路、IMD通路、JNK通路、JAK-STAT通路、模式识别蛋白和抗菌效应因子。Toll通路基因包括myd88、Toll-6、Toll-7、spz3、spz4、spz5、pll/tube、a PKC、ref(2)P、ECSIT和UBA2。其中pxy-miR-8523＿1ss16TG的靶基因为xSpz5。3.Toll途径相关基因的分子特点:(1)xSpz5 c DNA序列ORF长1281 bp,编码426个aa,主要在脂肪体和中肠中表达。xSpz5在三龄和四龄中表达量较高。蝉拟青霉、金黄色葡萄球菌可诱导xSpz5的表达量上调。(2)Px Toll、Px Tube、Px Dorsal和Px Cactus等Toll通路免疫基因在细菌和真菌的诱导下上调表达。4.xSpz5的RNAi的实验结果显示相比于ds GFP和DEPC水处理,在注射ds xSpz5后xSpz5基因的转录水平明显减少。用蝉拟青霉的孢子悬浮液侵染小菜蛾幼虫,与对照组相比,ds xSpz5处理组的死亡率显著增加。48 h存活率为63.3%,明显低于对照组、DEPC水组和ds GFP组。5.将pxy-miR-8523＿1ss16TG的mimic(模拟物)和inhibitor(抑制剂)注射到小菜蛾体内,RT-q PCR分析发现pxy-miR-8523＿1ss16TG的mimic注射组中xSpz5的表达量显著下降,而pxy-miR-8523＿1ss16TG的inhibitor注射组中在处理后表达量有所上调。与mimic-NC注射对照相比,蝉拟青霉侵染miRNA的mimic注射组显示小菜蛾幼虫的死亡率显著增加。侵染48 h,注射pxy-miR-8523＿1ss16TG mimic组的幼虫的存活率为61.7%,显著低于mimic-NC和CK组。通过本研究,分析宿主昆虫miRNA在免疫防御机制中的功能,可为利用昆虫病原真菌和真菌毒素防治害虫提供可能的靶点以及一些理论依据,理论上丰富我们对昆虫免疫的认知,应用上为新的害虫生物防治方法提供思路。