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背景:肝细胞肝癌是恶性程度较高,预后较差的消化系统恶性肿瘤之一。目前,对于肝癌的临床治疗主要以手术切除和肝脏移植为主,但是有相当比例的患者在确诊肝癌时已经失去了手术治疗的机会。因此,以化疗、分子靶向治疗为基础的药物治疗在肝癌进展期患者的临床治疗中就显得尤为的重要。然而,目前临床常用的化疗药物,如多柔比星、氟尿嘧啶和顺铂等都没有获得很好的临床治疗效果。肝癌细胞多药耐药的形成则是药物治疗效果欠佳的重要原因,而且目前对于肝癌细胞多药耐药形成的具体分子机制尚未阐释明确。所以,深入研究肝癌细胞多药耐药中的关键分子机制有望为肝癌药物治疗提供新的治疗思路与策略。YAP（Yes-associated Protein）基因在肝癌发生发展中起到了重要作用,且与肝癌细胞耐药形成密切相关,但是YAP介导肝癌细胞多药耐药的分子机制尚不明确。目的:本研究旨在探究YAP介导肝癌细胞形成多药耐药的分子机制。首先,在肝癌及癌旁样本中检测了YAP表达水平的差异性并分析其与肿瘤大小、疾病分期等临床病理特征之间的关系。运用一系列的动物实验和细胞功能学实验研究YAP在肝癌细胞多药耐药中的作用,利用免疫共沉淀等技术深入探究受YAP调控的下游分子,生物学过程和信号通路,进一步明确YAP介导肝癌多药耐药的具体分子机制。材料方法:1. 从肝癌组织样本库中调取93例肝癌及癌旁正常组织,通过免疫组织化学染色的方法检测YAP在肝癌和癌旁组织中的表达水平。运用Pearson相关性分析研究YAP在肝癌组织中的表达水平与肝癌患者临床病理特征之间的关系以及YAP与临床预后的关系。2. 运通Oncomine数据库中肝癌组织及细胞系的表达谱数据分析YAP在肝癌组织、癌旁组织和多种肿瘤细胞系中的表达水平。3.通过RT-q PCR和Western-blot技术检测了YAP在耐药细胞株BEL/FU和7种普通肝癌细胞系中的表达水平。4.用敲低和过表达慢病毒构建YAP稳定下调和过表达的细胞株或用YAP特异性的小分子抑制Verteporfin抑制YAP在耐药细胞系中的功能,通过CCK-8实验、集落形成、流式细胞术和裸鼠皮下成瘤等方法验证YAP对肝癌细胞多药耐药的促进作用。5.利用氧自由基探针、NADPH/NADP+检测技术、Western-blot技术、流式细胞术和集落形成实验研究YAP对肝癌细胞中氧自由基、NADP+的含量和RAC1表达水平的调控作用,同时明确了RAC1在YAP介导的多药耐药中所发挥的作用。6.通过免疫共沉淀实验和Western-blot技术探究了YAP对RAC1蛋白泛素化降解过程的调控作用,明确了介导RAC1蛋白降解的E3泛素连接酶。7.运用自噬双荧光报告实验和Western-blot技术探究了YAP、RAC1和氧自由基对m TOR通路及细胞自噬的调控作用。结合流式细胞凋亡检测验证了YAP通过RAC1和氧自由基调控m TOR活性,抑制细胞自噬,促进肝癌细胞耐药。结果:1.通过调取和分析Oncomine数据库中肝癌组织与不同类型肿瘤细胞系的表达谱数据发现YAP在肝癌组织及肝癌细胞系中呈现出高表达。免疫组织化学染色和Western-blot技术进一步验证了YAP在93例肝癌组织、部分普通肝癌细胞系和耐药细胞系BEL/FU中均呈现显著的高表达。而且,YAP在肝癌中的表达水平与临床病理特征中肿瘤病灶的数量密切相关,同时YAP的高表达还提示了肝癌患者的不良预后。2.体外的细胞功能学实验证明,YAP的过表达可以显著降低肝癌细胞BEL/7402在氟尿嘧啶或多柔比星处理后细胞的凋亡比例。而敲低或抑制YAP的表达和功能后,BEL/FU在氟尿嘧啶或多柔比星的作用下其IC50、集落形成能力和细胞增殖水平显著下降,细胞凋亡水平明显增高。3. 裸鼠皮下成瘤实验结果表明,YAP小分子抑制剂Verteporfin和氟尿嘧啶、多柔比星联用可以有效地抑制BEL/FU细胞皮下瘤的生长,且肿瘤组织中TUNEL+细胞的数量显著增加。4. YAP在肝癌细胞中的高表达抑制了肝癌细胞内氧自由基及氧化型辅酶II（NADP+）的产生。在氟尿嘧啶和多柔比星的作用下,RAC1是调控细胞氧自由基产生的关键基因,同时流式凋亡检测和集落形成实验表明YAP主要通过下调RAC1的表达来促进肝癌细胞的耐药。5. 运用免疫共沉淀和Western-blot技术,我们明确了YAP主要是通过促进RAC1的泛素化降解来下调RAC1蛋白的表达水平。HACE1则是介导RAC1泛素化降解的E3泛素连接酶,而且其表达受到YAP的调控。6. 在肝癌细胞中敲低YAP后可以下调m TOR蛋白及其下游分子（S6、4E-BP1）的磷酸化水平,相反过表达YAP后m TOR、S6和4E-BP1蛋白的磷酸化则明显的升高。同时,在肝癌细胞中敲低或过表达RAC1或中和细胞内氧自由基后可以逆转YAP对m TOR通路活化的调控作用。7. 用m TOR抑制剂（雷帕霉素）和氟尿嘧啶或多柔比星同时处理耐药株BEL/FU后,细胞中凋亡相关蛋白Cleaved-PARP和Cleaved-Caspase3的表达水平显著升高,且细胞自噬水平也明显升高。在肝癌耐药株中敲低YAP的表达后,细胞自噬水平明显增高,对氟尿嘧啶的敏感性和凋亡比例显著增加,但当同时用氯喹、3-MA或ATG3和BECN1的小干扰RNA阻断细胞自噬过程后可以明显逆转耐药细胞的凋亡水平。结论:1.YAP在肝癌组织中表现出显著的高表达,并且YAP的高表达与肝癌患者的不良预后密切相关。2.抑制或敲低YAP的功能和表达,可以显著增加耐药细胞株BEL/FU对氟尿嘧啶和多柔比星的敏感性。且YAP可以通过泛素化降解的途径下调RAC1的表达,抑制氧自由基的产生来促进肝癌细胞的耐药。3.在肝癌细胞中,YAP对RAC1和氧自由基的抑制作用,可以促进并维持m TOR蛋白的活化,最终抑制细胞在药物作用下发生过度的细胞自噬,从而提高了肝癌细胞的耐药性。