【摘 要】
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目的角膜碱烧伤由于角膜上皮缺损和大量细胞坏死,严重时可致溃疡、穿孔甚至角膜盲的形成,愈后差。前期研究发现,壳聚糖基原位水凝胶（In situ alginate-chitosan hydrogel,ACH）转载角膜缘干细胞（Limbal stem cells,LSCs）对角膜碱烧伤具有一定的修复作用,但由于载体孔径大小不一、细胞包载率低,修复效果不理想。本研究拟制备一种新型细胞载体,以提高细胞包载率
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目的角膜碱烧伤由于角膜上皮缺损和大量细胞坏死,严重时可致溃疡、穿孔甚至角膜盲的形成,愈后差。前期研究发现,壳聚糖基原位水凝胶（In situ alginate-chitosan hydrogel,ACH）转载角膜缘干细胞（Limbal stem cells,LSCs）对角膜碱烧伤具有一定的修复作用,但由于载体孔径大小不一、细胞包载率低,修复效果不理想。本研究拟制备一种新型细胞载体,以提高细胞包载率,改善修复效果。方法分别配制一定浓度的壳聚糖乙酸溶液、羧甲基壳聚糖（Carboxymethyl chitosan,CMCTS）溶液和β-甘油磷酸钠（Sodiumβ-glycerophosphate）溶液,将三者按一定比例混合,配制壳聚糖基温敏水凝胶（chitosan-based thermosensitive hydrogel,CTH）,利用4D生物打印技术、-20℃低温条件制成孔径均一的载体支架（4D-CTH）;扫描电镜观察其表面微观结构,并检测其溶胀率、粘弹性和化学结构;提取并体外培养SD大鼠LSCs,免疫荧光实验观察P63细胞阳性率并鉴定细胞;Cell countig kit-8（CCK-8）实验检测4D-CTH的细胞毒性,划痕实验检测4D-CTH对LSCs迁移的作用,Calcein-AM/PI细胞染色实验检测4D-CTH对LSCs的增殖及形态是否有影响,验证4D-CTH的细胞相容性;建立大鼠角膜中重度碱烧伤模型,利用4D-CTH转载LSCs至损伤角膜进行修复,外眼像及裂隙灯观察角膜浑浊度和新生血管生成情况,荧光素钠染色评价缺损上皮的愈合情况;角膜组织石蜡切片HE染色和冰冻切片免疫荧光染色评价4D-CTH转载LSCs对角膜碱烧伤的治疗效果。结果制备的4D-CTH载体孔径均一,37℃时呈凝胶状;扫描电镜显示载体具有规则的孔径,溶胀率约为1100%;粘弹性测定结果显示,制备的水凝胶储能模量总是大于损耗模量,显示出典型的水凝胶样特性。体外培养的大鼠LSCs贴壁生长,相互融合,以多边形为主,核质比大,呈“铺路石”状排列。免疫荧光实验发现细胞P63阳性率超过90%（P>0.05）,而K3+K12的阳性率低于20%（P<0.001）,证实提取的LSCs纯度高。CCK-8实验结果表明,4D-CTH细胞载体对LSCs的增殖无明显抑制作用（P>0.05）;划痕实验发现,4D-CTH组在24h和48h的伤口愈合率分别为53.49%和93.28%,显著高于同期对照组（39.39%和72.08%,P<0.01）,这表明4D-CTH细胞载体可以促进LSCs迁移生长;Calcein-AM/PI细胞染色结果表明,4D-CTH细胞载体对LSCs的活性和形态无显著影响（P>0.05）。与模型组和传统治疗组相比,4D-CTH治疗组可以显著减少角膜新生血管生成率,降低角膜浑浊度,加速角膜上皮重建（P<0.05）。角膜组织石蜡切片HE染色结果显示,4D-CTH治疗15天后,角膜结构完整,上皮层和基质层界限清晰,上皮层连续且光滑;角膜组织冰冻切片免疫荧光染色显示,15天后,4D-CTH治疗组上皮有连续的K3+K12蛋白表达,角膜基本恢复正常。结论制备的4D-CTH细胞载体具有良好的细胞相容性,载体孔径大小均一,显著提高了细胞转载率;利用4D-CTH载体转载LSCs可显著改善损伤局部细胞生长微环境,促进角膜修复效果,加速损伤上皮组织的重建,促进损伤组织的修复。
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