茯苓类药材来源于多孔菌科真菌茯苓(Poria cocos(Schw.)Wolf)的干燥菌核。根据入药部位和功效不同,常分为茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神四种。茯苓皮是茯苓菌核的外皮部分,有利水消肿之功效;赤茯苓为茯苓菌核近外表皮部淡红色部分,有行水利湿热、益心润肺之功效;茯苓为菌核中间白色部分,有利水渗湿、益脾和胃之功效;茯神为菌核中心抱有松根部分,有宁心、安神、利水之功效。随着茯苓皮、赤茯苓、茯苓、茯神入药部位由表及里,其行水利尿作用逐渐减弱而宁心安神作用增强。化学成分研究表明茯苓三萜类化合物是茯苓类药材的主要活性物质,种类多样。目前为止,茯苓不同药用部位的茯苓三萜类化合物在体内的药物代谢动力学差异尚无系统研究,因此尚不明确造成茯苓类药材功效之间差异的具体化学成分和作用机制。本研究利用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,建立一个可同时定量分析大鼠血浆中多种茯苓三萜类化合物的方法,应用于比较茯苓类药材在大鼠体内药物动力学方面的差异,并发现和鉴定茯苓皮提取液在大鼠体内的代谢物,推测可能的代谢途径。第一部分茯苓类药材中茯苓三萜类化合物的药物动力学比较目的:建立生物样品中茯苓类药材8种茯苓三萜类化合物的UHPLC-Q-TOF-MS/MS定量测定方法,研究茯苓类药材在大鼠体内的药物动力学特征,初步探讨其药物动力学的差异。方法:1茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮灌胃液的制备:将茯神、茯苓、赤茯苓、茯苓皮用90%乙醇加热回流提取,提取液过滤,减压除醇,加适量水溶解,分别制备成茯神灌胃液(相当于2.5 g/m L原药材)、茯苓灌胃液(相当于2.5 g/m L原药材)、赤茯苓灌胃液(相当于2.0 g/m L原药材)、茯苓皮灌胃液(相当于2.0 g/m L原药材)。2生物样品的采集和预处理:取24只250±30 g的雄性Sprague-Dawley大鼠,随机分为4组,按体重以生药材25 g/kg的给药量,分别灌胃给予上述4种溶液。茯神、茯苓、茯苓皮分别于给药后5 min,10 min,30 min,1 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h,36 h,48 h;赤茯苓于给药后10 min,30 min,1 h,2 h,4 h,8 h,12 h,24 h,36 h,48 h,72h眼内眦静脉丛取血,采用乙腈沉蛋白的方法处理血浆样品。3样品分析条件:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术。ACQUITY UPLC?BEH C18(2.1×100 mm,5μm)色谱柱。流动相为0.5‰甲酸-0.5 m M乙酸铵水溶液和乙腈。ESI电离,子离子扫描模式,在负离子模式下检测茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、猪苓酸C、茯苓新酸AM、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸、常春藤皂苷元。采用高分辨的单个子离子计算峰面积,并采用内标法加权(1/x~2)一元线性回归定量。4药物动力学研究与分析:根据测定结果,绘制药时曲线,采用DAS3.0非房室模型计算药物动力学参数,并比较4种药材给药的药物动力学差异。结果:大鼠血浆中茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、猪苓酸C、茯苓新酸AM、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在测定浓度范围内线性关系良好(r≥0.9930)。批内、批间精密度的相对标准偏差(RSD)均小于10.3%,相对误差(RE)为-6.1%~7.7%。基质效应于91.4%~112.3%范围内,平均提取回收率为72.6%~102.6%。茯苓新酸AM在各组中均无吸收,茯苓新酸B、去氢土莫酸、茯苓新酸A、猪苓酸C、去氢茯苓酸、茯苓酸、松苓新酸在茯苓皮组中吸收量最大。结论:本方法快速、灵敏、专属、稳定,可以用于茯苓类药材在体内成分的测定,为研究茯苓类药材药理作用机制提供了依据。第二部分茯苓皮在大鼠体内吸收组分和代谢物的鉴定目的:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,结合Peakview和Metabolite Pilot数据分析软件,分析鉴定茯苓皮在大鼠血浆、胆汁和尿液中的吸收组分和代谢物,探索其活性成分在体内的代谢途径。方法:1茯苓皮灌胃液的制备:将茯苓皮用90%乙醇加热回流提取,提取液过滤,减压除醇,用水稀释至相当于2.0 g/m L的原药材。2生物样品的采集和预处理:取12只雄性Sprague-Dawley大鼠,体重250±30 g,随机分为4组,每组3只,按体重以25 g/kg的给药量灌胃给予大鼠,分别采集给药后1、2、4、8、12、24和36 h时的血浆样品,24 h的胆汁样品和72 h的尿液,分别合并所有的血浆、胆汁样品和尿样。将合并的生物样品分别用3倍量的乙酸乙酯萃取,萃取3次,每次15 min。合并乙酸乙酯层,减压干燥,残渣用甲醇溶解。3样品分析条件:采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术分析样品。色谱柱为Phenomenex Luna 3μC18(2)100A(150×2.0 mm),流动相为2mmol/L的乙酸铵-0.1%甲酸水溶液和乙腈,梯度洗脱;高分辨质谱采用ESI源,负离子模式,全扫描采集,采用动态背景扣除和信息依赖采集触发二级碎片的采集,每一循环采集8个最强峰的二级质谱图。4代谢物发现和鉴定的步骤:首先结合文献,建立茯苓皮中茯苓三萜类已知化合物的信息库。然后用Peakview 2.0软件寻找血浆中的吸收组分、胆汁和尿样中的原型药物。再将这些吸收组分按照结构特点进行分类,选择有对照品且吸收量较大的化合物作为母药,用Metabolite Pilot 1.5软件以母药为模板进行分析,寻找生物样品中主要代谢物。最后根据茯苓三萜类的裂解规律和化合物的极性,解析代谢物的结构,及其可能的代谢转化途径。结果:通过Peakview 2.0,在血浆中寻找到15种主要的吸收组分;按结构将其分为4类,其中3类分别以茯苓酸、茯苓新酸A和去氢土莫酸为母药;利用Metabolite Pilot 1.5软件进行数据分析,寻找并初步鉴定其代谢物,共鉴定出102种成分,主要的代谢类型为甲基化、氧化、水解、氢化和葡萄糖醛酸结合等。结论:本研究采用UHPLC-Q-TOF-MS/MS技术,成功发现和鉴定了茯苓皮大鼠体内代谢物,为茯苓皮体内过程的阐明奠定了基础。