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随着分子生物学的发展,人类对于DNA重组技术的认识逐渐成熟,肿瘤基因治疗作为治疗肿瘤的新手段应运而生。在肿瘤基因治疗中,载体以及运输细胞的选择尤为关键。我室一直致力于安全,高效的非病毒载体的研究与开发,在前期研究中已经成功构建了针对肿瘤基因治疗的载体：pHrneo-IL24。在靶细胞的选择上,MSCs具有向肿瘤位置迁移和趋近的能力,并且易于分离,可分化为多种细胞,有报道表明MSCs已应用于肿瘤治疗的临床前试验。MSCs的靶向基因修饰可进一步促进其在肿瘤基因治疗中的疗效,但MSCs的基因修饰一直是个技术难题,靶向基因编辑技术——核酸工程酶TALEN的出现为突破此难题提供了良好的工具。因此,本研究拟结合TALENickases(我室已建立的TALEN高效突变体),利用携带IL-24的核糖体基因区靶向载体pHrneo-IL24对MSCs进行基因打靶,以期得到稳定表达有生物学活性IL-24蛋白的定点整合克隆。目的：使用pHrneo-IL24载体系统联合TALENickases打靶MSCs,以期得到稳定表达IL-24的MSC细胞株。方法：1.MSCs的分离与培养：从骨髓标本中分离骨髓中的单核细胞,再用贴壁培养分离出骨髓间充质干细胞(MSCs)。2.流式鉴定扩大培养的MSCs表面标志物。3.将TALENickases以及pHrneo-IL24质粒通过核转,共转染至MSCs,镜下通过观察融合的GFP蛋白表达,分析转染效率。4、转染后细胞分两线接种,一线加入G418筛选定点整合克隆,另一线直接扩增培养。5.抽提打靶后细胞gDNA,定点整合PCR鉴定rDNA区整合细胞。6.收集打靶后细胞上清,ELISA检测细胞克隆IL-24蛋白的表达量。结果：1.从骨髓标本中分离出的MSCs呈短梭形,形态规整,数次传代后,呈成纤维状,流式结果显示符合MSCs的各项表面标志物表达；2.核转后的MSCs镜下可见绿色荧光表达,G418筛选后的细胞大量死亡,未得到定点整合的单克隆细胞。3.扩增未加G418筛选的转染后MSCs,抽提gDNA后,通过定点整合PCR检测到混合细胞中存在一定量的定点整合细胞。4.收集混合细胞上清,通过ELISA可检测到17.459ng/ml的IL-24蛋白表达。结论：成功分离并得到MSCs,初步验证联合TALENickases以及pHrneo-IL24载体能将IL-24表达框靶入到MSCs核糖体基因区,并分泌IL-24蛋白。