目的: 宫颈癌是危害妇女健康的常见恶性肿瘤，死亡率为妇科恶性肿瘤之首，从宫颈癌前病变发展成为宫颈癌是一个较为漫长的过程，大约需要十年甚至更长，因此，宫颈癌是一个可预防、可治愈的疾病。及时发现早期宫颈癌，及时恰当的处理，治愈率几乎达100%。因此，在宫颈病变的早期及时阻断其向恶性方向发展，防止宫颈癌发生，具有重要意义。现已证实人乳头瘤病毒（Human papilloma virus，HPV）是宫颈癌的重要致病因素，但由于HPV病毒尚未能在体外成功培养，故关于宫颈癌的预防性研究相对滞后。本实验在前人研究的基础上，筛选一种诱导宫颈癌细胞凋亡的药物——大蒜素，观察其是否能对整合入Hela细胞中的HPV18病毒基因序列中的癌基因E6、 P53和端粒酶的表达产生影响，以此为基础来推测该种药物能否对HPV病毒基因序列中的E6基因产生影响，从一个新的角度对HPV病毒的生物学性状进行研究。为宫颈癌的临床预防、治疗提供实验室理论依据。方法1细胞培养：常规方法复苏冻存于液氮罐中的人宫颈癌Hela细胞，接种于含10%胎牛血清RPMI~1640培养液的培养瓶中，置于37℃、5%二氧化碳饱和湿度培养箱内培养，每天观察细胞生长情况，待细胞生长至70%融合时（约2~3<WP=4>天），EDTA消化，制成单细胞悬液，以备实验用。2 MTT比色法测定细胞生长抑制情况：调整细胞密度至3×104个细胞/ ml，充分混匀，接种到96孔培养板中，每孔200μl，置于培养箱内培养，至对数生长期，吸去上清液，实验组分别加入200μl新鲜配制的不同浓度的大蒜素培养液，浓度分别为25mg/L、 50 mg/L、 100 mg/L，对照组加入200μl培养液。每天于显微镜下观察细胞生长情况，分别于24小时、48小时、72小时取出培养板，每孔加入20μl（浓度为5g/L）MTT，轻振培养板，置培养箱中孵育4小时后，弃去上清液，加入二甲基亚砜200μl，室温震荡8分钟，使其彻底溶解，于酶标仪570nm波长处测其吸光度A值，计算出抑制率（IR）。同法重复实验3次。抑制率（IR）=（1–实验组A值/对照组A值）×100%。3光学显微镜观察细胞形态：调整细胞密度至3×104个细胞/ ml，接种到预置盖玻片的24孔培养板中，每孔1ml。置于培养箱内培养，至对数生长期，更换培养液，加入药物。实验组加入终浓度分别为25mg/L、 50 mg/L、 100 mg/L、200 mg/L的大蒜素，同样设对照组，12小时、18小时、24小时、48小时、72小时后取出盖玻片，Gimsa染色，光镜下观察细胞形态。4透射电镜观察细胞形态：将细胞按照上述浓度接种于培养瓶中，上述浓度药物作用12小时、18小时、24小时、48小时、72小时后，收集细胞，2.5%戊二醛前固定，清洗后1%锇酸后固定，常规脱水，浸透，环氧树脂包埋，切成超薄切片，透射电子显微镜观察细胞形态。5 TUNEL法检测细胞凋亡：按照光学显微镜观察细胞<WP=5>形态方法获得细胞爬片，置于培养箱内培养，至对数生长期，更换培养液，加入药物。药物浓度同上，设对照组。24小时、48小时、72小时后，按照TUNEL试剂盒说明操作，对细胞爬片进行处理，细胞核染成棕褐色者为凋亡细胞，核蓝色者为阴性。每个视野计数100个细胞，每张片计数3个视野，阳性细胞数占细胞总数的百分率即为凋亡指数（AI）。6用PCR和RT–PCR方法研究HPV18 E6基因、P53基因、hTERT基因表达在细胞凋亡过程中的变化：用Trizol提取细胞总RNA。取扩增产物，经1.5％琼脂糖凝胶电泳（含EB），90V，45分钟，在紫外灯下观察结果，并在读胶仪AlphaImager1200上进行扫描，观察条带的灰度强弱，结果以目的基因与β–actin的积分吸光度的比值表示。结果1光学显微镜下细胞形态学改变：Hela细胞形状不规则，可为多角形、梭形等，核仁2~3个。大蒜素作用48小时，经Gimsa染色，光镜下可见细胞体缩小，胞膜完整，核染色质致密固缩，聚集于细胞核一侧，呈新月形；聚集于核的两端，呈八字形；聚集于整个核膜，呈周边化；或者可见到细胞核碎裂为花瓣状、大小不等的核片断。2三种浓度大蒜素作用于细胞24小时、48小时、72小时细胞生长受到不同程度的抑制，明显高于对照组；各浓度间及各时间抑制率差异显著（P <0.05）。呈剂量、时间依赖性。72小时抑制率分别为38.46%、56.25%、65.32%、76.33%。3透射电子显微镜下细胞形态学改变：实验组细胞呈现细胞凋亡样改变: 表现为细胞体积变小，细胞微绒毛消失，<WP=6>胞内大量空泡形成；常染色质增加，核质比例减小；部分细胞呈典型的凋亡改变：核膜内陷，不规则，细胞染色质边集，固缩，紧靠核膜，聚居于细胞核核膜下，呈境界分明的团块状、花瓣状，细胞核碎裂、固缩，胞质呈片状脱落。随着药物浓度的增加及时间的延长愈加明显。对照组凋亡现象不明显，染色质分布均匀，可见1~2个核仁。4 TUNEL标记结果：大蒜素作用不同时间后，凋亡细胞胞核经TUNEL染色呈棕褐色，核固缩、染色质凝集成块儿或边集。三种浓度大蒜素作用24、48、72小时细胞凋亡率均明显高于对照组（P <0.01），各浓度间凋亡率比较差异亦有显著意义（P <0.01）。5大蒜素对Hela细胞株中HPV18E6、hTERT表达的影响：用RT-PCR检测Hela细胞株中HPV18E6基因表达，对照组和实验组Hela细胞均在352bp处扩增出?