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裂头蚴病(sparganosis)是由迭宫属绦虫的幼虫-裂头蚴(plerocercoid)侵入人体引起的一种严重的自然疫源性疾病,在我国及东南亚国家该病主要是由曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)裂头蚴引起的。裂头蚴病的临床表现因寄生部位而异,复杂多样且缺乏特异性。目前裂头蚴病的诊断主要是病原学检查、影像学检查和血清学检查,但病原学诊断非常困难,活检时很难发现虫体,尤其是当裂头蚴在中枢神经系统寄生时,手术探查的风险较大；影像学检查只能定位,不能定性。应用裂头蚴虫体可溶性抗原(粗抗原)及排泄分泌(excretory-secretory, ES)抗原进行血清学诊断时易与其他蠕虫病发生交叉反应。为了寻找敏感和特异的早期诊断抗原,我们前期将裂头蚴可溶性抗原与ES抗原分别进行了双向电泳,应用裂头蚴早期感染血清进行Western blotting鉴定,将早期感染血清识别的蛋白点进行质谱分析后鉴定出一种半胱氨酸蛋白酶(cysteine protease, CP)CP是在其活性中心具有半胱氨酸残基的一种蛋白水解酶,具有良好的抗原性,在寄生虫生长与发育中具有重要的生物学功能。本研究对裂头蚴半胱氨酸蛋白酶(SeCP, ID:D63670;蛋白ID:BAA09820, GI:1834307)全长基因进行了生物信息学分析、克隆、原核表达,并对重组SeCP (rSeCP)进行了免疫学鉴定、酶活性及功能特性分析,将其用于不同剂量裂头蚴实验感染小鼠后不同时间血清特异性抗体的检测,通过ELISA观察了rSeCP诊断裂头蚴病人的敏感性与特异性。材料与方法1.裂头蚴、血清、质粒和菌株从河南省开封地区感染裂头蚴的野生青蛙肌肉中分离裂头蚴,按重度(5条/只)、中度(3条/只)、轻度(1条/只)分别感染小鼠,感染后2-28d隔天采集血清备用。裂头蚴感染家猫后收集成虫经形态学与分子生物学鉴定为曼氏迭宫绦虫(Spirometra mansoni)。试验血清包括裂头蚴、旋毛虫、弓形虫与日本血吸虫感染小鼠血清,以及裂头蚴病、棘球蚴病、旋毛虫病、日本血吸虫病、并殖吸虫病、华支睾吸虫病、猪囊尾蚴病等寄生虫病患者血清。克隆载体pGEM-T (Promega)、大肠杆菌DH5a,原核表达载体pMAL-c2X 和 TB1均购白New England Biolabs。1. SeC P的生物信息分析及克隆、表达及鉴定利用NCB、EMB、ExPasy等在线网站对SeCP进行生物信息学分析,然后对SeCP基因进行分子克隆、表达和纯化,将纯化后的rSeCP免疫BALB/c小鼠获得免疫血清并对其引起的免疫应答类型进行了观察,通过Western lotting分析其抗原性和免疫原性,应用RT-PCR观察SeCP基因在曼氏迭宫绦虫不同发育期的转录情况；应用间接免疫荧光试验(IFT)对SeCP蛋白在曼氏迭宫绦虫不同发育期的表达及其在虫体组织的定位进行了分析。2.rSeCP酶活性鉴定及功能分析将纯化的rSeCP进行明胶酶谱分析(含有0.1%明胶的12% SDS-PAGE)检测其活性。采用Z-Phe-Arg-AMC测定蛋白酶的活性以及酶动力学分析,在激发波长为355 nm和发射波长为460 nm时检测rSeCP催化生成的产物AMC的生成速率,进而得到rSeCP的催化效率,并测定了温度、pH、金属离子(Cu、Mn、Zn)和特异性抑制剂(E-64等)对rSeCP活性的影响。分别应用兔与人的免疫球蛋白、牛血红蛋白(Hb)、纤连蛋白、胶原蛋白I与IV及牛血清白蛋白观察rSeCP的水解功能。将rSeCP与rSeCP免疫血清孵育后,观察rSeCP免疫血清对rSeCP酶活性及水解功能的抑制作用,以及抗rSeCP抗体依赖细胞介导的3.rSeCP用于裂头蚴感染小鼠与裂头蚴病人血清抗体的检测应用rSeCP与裂头蚴ES抗原分别建立检测裂头蚴抗体IgG的rSeCP-ELISA与ES-ELISA方法,检测不同剂量裂头蚴感染小鼠后不同时间血清抗体水平,观察rSeCP-ELISA对裂头蚴感染早期及轻度感染的诊断效果。检测裂头蚴感染小鼠及其他寄生虫感染小鼠、裂头蚴病人及其他寄生虫病人血清抗体水平,观察rSeCP-ELISA诊断裂头蚴病的敏感性与特异性。4.统计学处理采用统计分析软件SPSS 17.0 (SPSS Inc., Chicago, IL)处理数据和分析统计。OD值用平均值±标准差表示,不同感染组及不同时间点的差异用重复测量设计的方差分析和卡方检验进行统计分析,检验水平位a=0.05。结果1. SeCP的生物信息分析及克隆、表达及鉴定SeCP基因序列全长1053bp,含有一个较大的1011bp ORF,编码336个氨基酸,其中包括一个完整的组织蛋白酶抑制剂结构域和一个peptidase_CIA conserved domain保守结构域；含有信号肽序列,且具有良好的抗原性。利用克隆表达技术成功构建重组表达质粒pMAL-c2X-SeCP/TBl, IPTG诱导表达出重组蛋白,且以可溶与包涵体2种形式存在,应用Amylose树脂纯化出目的蛋白。将纯化后的rSeCP免疫BALB/c小鼠获得免疫血清,ELISA检测免疫血清的效价为1：106。抗体IgG亚型分析发现,IgGl水平显著升高,提示rSeCP免疫小鼠主要引起Th2型免疫反应。Western blotting结果显示,rSeCP可被裂头蚴感染小鼠血清及rSeCP免疫血清识别,rSeCP免疫血清可识别裂头蚴可溶性蛋白和ES蛋白中的天然成分。RT-PCR和IFT结果分析发现,SeCP基因在鼠体、蛙体裂头蚴中均有转录和表达,但在成虫期不转录也不表达,表明SeCP是裂头蚴期特异性蛋白。SeCP蛋白主要定位在裂头蚴的皮层与实质组织。2.rSeCP酶活性鉴定及功能分析通过明胶基质凝胶电泳鉴定,发现rSeCP具有半胱氨酸蛋白酶活性,在蛋白对应大小位置出现一条水解带,水解作用能被E-64抑制。利用半胱氨酸蛋白酶特应性底物Z-Phe-Arg-AMC测得rSeCP在pH 3.3至pH8.5之间均具有活性,并且在pH为5.5时活性最高,最佳反应温度为37℃,测定米氏常数Km=1.56 nM/min,最大反应速度Vm=4.051 nM/min; rSeCP对底物Z-Phe-Arg-AMC的活性几乎不被丝氨酸蛋白酶类抑制剂(ABESF、PMSF)和金属蛋白酶类抑制剂(1,10-菲洛林,EDTA)所抑制,但能被E-64显著性抑制；酶的活性被Cu、Mn及Zn离子抑制,而且具有剂量依赖性。rSeCP对免疫球蛋白、胶原蛋白、纤连蛋白和牛血红蛋白均具有降解作用；在最适条件下,重组蛋白浓度越高,对基质蛋白的降解越彻底；将抗rSeCP血清按1：50、1：100、1：500、1：1000稀释后与rSeCP共孵育,酶的活性被抑制,具有剂量依赖性。ADCC实验显示,抗rSeCP抗体对裂头蚴具有杀伤作用。3.rSeCP用于裂头蚴感染小鼠后不同时间血清抗体的检测应用rSeCP-ELISA对重、中、轻度裂头蚴感染小鼠血清进行检测时,发现SeCP-ELISA首次检测到特异性抗体的时间分别为感染后10 d (20%,2/10)、10d(20%,2/10)和12 d(10%,1/10)；在感染后14d、22d和22d抗体阳性率均为100%,且抗体水平继续逐渐升高直到实验结束时的感染后28d；而ES-ELISA重、中、轻度裂头蚴感染小鼠首次检测到特异性抗体的时间则分别为感染后d(10%,1/10)、8d(50%,5/10)和8 d(20%,2/10),在感染后8d、12d和14dpi流体阳性率均达到100%。两种抗原的检测结果均表明,3组裂头蚴感染小鼠之司的抗体水平均随着感染剂量的增大而升高,3组小鼠血清抗体水平之间的差有统计学意义(FrSeCP=10.029,FES=5.901, P<0.05);感染后不同时间点之间抗本水平的差异亦具有统计学意义(FrSeCP=308.184,FES=601.727,P<0.05)；感染时司和感染剂量之间存在交互关系(FrSeCP=4.266, FES=5.808, P<0.05)。.rSeCP诊断裂头蚴病的敏感性和特异性应用rSeCP-ELISA和ES-ELISA分别对裂头蚴、弓形虫、日本血吸虫、旋虫感染小鼠和正常小鼠血清进行了检测,结果发现两种抗原检测裂头蚴感染小鼠的抗体阳性率分别是9667% (29/30) and 100% (30/30) (P>0.05),与弓形虫,旋毛虫,血吸虫感染小鼠血清均无交叉反应。rSeCP-ELISA和ES-ELISA险测裂头蚴病病人血清时抗体阳性率均为100%；rSeCP-ELISA检测其他寄生虫病人血清时,分别与囊尾蚴病、日本血吸虫及并殖吸虫病有1例(5.00%)交叉反应,棘球蚴病、华支睾吸虫病、旋毛虫病及健康人血清均为阴性。应用ES-ELISA检测其他寄生虫病人血清时,与棘球蚴病、囊尾蚴病、华支睾吸虫禹、日本血吸虫病及并殖吸虫病患者血清的交叉反应率分别为15%(3/20)、5%1/20)、28.57%(2/7)、10%(2/20)和65.00%(13/20),旋毛虫病人及健康人血清均为为阴性。rSeCP-ELISA诊断裂头蚴病人的特异性为98.22%(166/169),凋显高于ES-ELISA的87.57%(148/169)(P<0.05)。结论1.构建了裂头蚴SeCP基因的重组表达质粒pMAL-c2X-SeCP/TB1;诱导纯化出可溶性rSeCP。 SeCP基因只在曼氏迭宫绦虫裂头蚴期转录和表达,在成虫期和虫卵期不表达,主要定位于虫体皮层和实质组织。2. rSeCP具有良好的抗原性、免疫原性及天然的半胱氨酸蛋白酶活性与水解宿主蛋白的功能。3. rSeCP检测裂头蚴感染小鼠和裂头蚴病人血清抗裂头蚴抗体均具有良好的敏感性,其特异性明显优于ES抗原,rSeCP可作为裂头蚴病的血清学诊断抗原。