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有丝分裂是真核细胞生命周期中最普遍且重要的进程。在细胞由间期进入有丝分裂期时,有以下一系列事件的发生,包括染色质凝集,核膜解体,纺锤体的形成和染色体的分离等。研究表明这些事件的发生与磷酸化与去磷酸化的进行有直接的联系,因此,研究蛋白质的磷酸化对于弄清细胞周期进程的详细机制有重要意义。MPM-2单克隆抗体能够以磷酸化依赖的方式识别在有丝分裂期特异发生磷酸化的一批蛋白。已知很多MPM-2抗原或是定位于参与有丝分裂期细胞器上,或是参与细胞周期调控的重要信号因子。所以,对MPM-2抗原的研究,有助于拓展我们对细胞周期调控机制的认识。
本课题组前期工作中用蛋白质组学方法成功鉴定了39个可能的新MPM-2抗原,是迄今鉴定MPM-2抗原最多的一次。我们选择了其中反应性较强的CCT2蛋白,对其进行以下研究,并确定其为MPM-2抗原。1)Western blot实验显示CCT2蛋白在PVDF膜上的位置随细胞周期的进行呈现周期性变化,暗示着CCT2蛋白随细胞周期进程发生可逆的磷酸化修饰;2)共定位实验:间接免疫荧光实验和双向电泳显示,在有丝分裂期CCT2的抗体能够和MPM-2共定位;3)Western blot实验中,MPM-2抗体和CCT2抗体在有丝分裂期有共迁移现象,而在间期没有此现象。以上结果表明CCT2蛋白为MPM-2抗原之一。
而后我们采用RNAi技术对CCT2蛋白进行了初步的功能研究。首先,CCT2蛋白被沉默的Hela细胞株的生长速度减慢、对血清的依赖性增强,说明CCT2对细胞的生长和增殖有重要作用。其次,为了研究CCT2的功能调控机制,对沉默细胞株及对照细胞株的蛋白进行了双向电泳分析,发现差异蛋白中也有MPM-2抗原,提示我们MPM-2抗原之间可能存在着某种必然联系。