NGF对人癫痫脑神经细胞及Egr-1表达的影响

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【目的】了解癫痫患者脑脊液中神经生长因子(nerve growth factor, NGF)水平,研究不同浓度NGF对人癫痫脑海马CA1区神经细胞总数,以及星形胶质细胞、神经元存活数量的影响,同时研究了不同浓度NGF对神经细胞Egr-1mRNA表达的影响,以探讨NGF对癫痫脑损伤神经细胞作用和机制。【方法】应用酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay ,ELISA)分别测定癫痫组(n=28)及非癫痫对照组(n=21)脑脊液中NGF水平;采用解离细胞即刻培养技术,对经检查痫样放电起源于颞叶或海马,而病理检查未发现特异病理改变的人癫痫海马CA1的神经细胞(n=16)进行培养,并设立浓度分别为12.5, 50, 100 ng/ml的NGF加药组和未加NGF的空白对照组,培养4h后,通过免疫荧光细胞化学法,以双苯酰亚胺(Bisbenzimide,Bb)染核,联合细胞特异性标志蛋白GFAP、MAP2标记星形胶质细胞、神经元,计数存活的神经细胞总数,及星形胶质细胞和神经元数,并计算星形胶质细胞和神经元占总神经细胞的百分比,同时利用RT-PCR技术半定量分析不同浓度NGF对神经细胞表达早期生长反应基因-1(early growth response gene-1, Egr-1)mRNA的影响。【结果】1.癫痫组和非癫痫对照组脑脊液中NGF含量分别(27.31±6.36)pg/ml、(24.09±4.96)pg/ml,两组中脑脊液NGF水平无显著性差异(P>0.05)。2.在NGF浓度为12.5、50、100ng/ml时,海马CA1区神经细胞数分别为(82.02±11.08)、(104.71±14.24)、(127.11±14.35)个/视野,与未加NGF的空白对照组(67.71±9.21)个/视野相比,差异具有显著性意义(P<0.01),神经元存活总数随NGF浓度增高而增加,与NGF剂量呈量效关系(P<0.01)。3.当NGF浓度为0、12.5、50、100ng/ml时,GFAP(+)的星形胶质细胞数分别为(23.11±4.39)、(30.73±5.16)、(44.25±6.76)、(59.57±6.23)个/视野;而MAP(2+)神经元数分别为(8.82±1.74)、(14.81±2.87)、(22.51±3.10)、(32.17±2.52)个/视野,星形胶质细胞和神经元存活数与NGF剂量呈量效关系,随NGF浓度增高而增加(P<0.05)。4.随着NGF浓度的升高,星形胶质细胞和神经元占神经细胞百分比有所升高,显示出相同的增高趋势。NGF浓度分别为0、12.5、50、100ng/ml时, GFAP(+)的星形胶质细胞和MAP2(+)的神经元占神经细胞百分比中位数(四分位间距)分别为34.94(31.16~36.91)%、38.49(34.70~39.94)%、42.36(40.22~45.13)%、45.92(43.79~51.53)%和13.01(10.65~15.55)%、18.35(16.37~19.92)%、21.94(21.36~22.84)%、25.33(23.98~26.84)%;比较不同浓度的NGF对GFAP(+)的星形胶质细胞和MAP2(+)的神经元占神经细胞百分比改变的影响时发现,差别无显著意义(P>0.05)。5.当NGF浓度为0、12.5、50、100ng/ml时,神经细胞表达Egr-1mRNA即AEgr-1/Aβ-actin分别为(0.46±0.14)、(0.63±0.14)、(0.80±0.15)、(1.12±0.12),加药组与未加NGF对照组比较,存在显著性差异(P<0.01),同样神经细胞表达Egr-1mRNA量与NGF剂量呈量效关系,随NGF浓度增高而表达量增加(P<0.01)。且在NGF作用下,神经细胞数与相应表达的Egr-1mRNA的量成正相关(r=0.780,P <0.01)。【结论】研究结果发现难治性癫痫人脑脊液中NGF水平较非癫痫对照组无明显升高;在(12.5~100)ng/ml范围内时,NGF可提高体外培养人癫痫脑海马CA1区神经细胞数,及GFAP(+)星形胶质细胞和MAP2(+)神经元数量,这一作用与NGF浓度的升高呈正相关,提示了NGF对神经细胞具有保护作用;比较不同浓度的NGF对星形胶质细胞和神经元存活率的提升作用,均显示无显著差异,提示了NGF对人癫痫海马CA1区星形胶质细胞和神经元均有保护作用;NGF对神经细胞表达Egr-1mRNA有促进作用,其表达量的增加与NGF浓度呈正的量效关系,提示了Egr-1在NGF介导的神经细胞保护中可能起重要作用。
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