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中华蜜蜂(Apss cerana cerana)是我国土生土长的优良蜂种,在我国大部分地区均有分布。中华蜜蜂囊状幼虫病最早是1972年在我国广东省佛岗县的中华蜜蜂蜂群发生,对我国中华蜜蜂种群构成了严重威胁,将该病原命名为中华蜜蜂囊状幼虫病病毒(Chinesesacbrood virus,CSBV)。CSBV使幼虫不能化蛹,形成囊状;也能感染成年蜜蜂,但没有明显的症状。目前尚无治愈中华蜜蜂囊状病的方法和特效药物,主要以预防为主。CSBV在福建省中华蜜蜂蜂群内存在近40年,对福建中华蜜蜂造成严重危害。目前,对福建省发生的CSBV研究很少,CSBV福州分离物(CSBV-FZ)的基因组序列信息还未知;且CSBV相关蛋白的功能及复制机制还未曾报道。本研究通过基因克隆获得CSBV-FZ全基因组序列,GenBank序列登录号为KM495267。CSBV-FZ基因组全长8808 bp,编码28488氨基酸。CSBV-FZ与其他蜜蜂囊状幼虫病病毒(Sacbroodvirus,SBV)分离物的核苷酸同源率和氨基酸同源率分别为90-97%和94-99%。利用Clustal X 2.0与MEGA 5.2软件分析不同地区SBV分离物的遗传关系,形成3个类群。来自印度地区的7个SBV分离物聚在一起为第1个类群;来自越南的AcSBV-SBM2为第2个类群;而来自美国,韩国和中国的SBV分离物聚在一起为第3个类群。在第3个类群中,从西方蜜蜂(Apismellifera)中分离的SBV分离物为一个亚群;而从东方蜜蜂(Apis cerana)分离的CSBV分离物为另一个亚群。这些结果说明SBV分离物的亲缘关系差异与其寄主和地理环境密切相关。本研究利用杆状病毒表达系统和酵母双杂交技术研究CSBV结构蛋白VP1和非结构蛋白RdRp之间的关系。首先利用原核表达系统制备VP1蛋白与RdRp蛋白的多克隆抗体,用Western blot和ELISA检测抗体的特异性。利用免疫荧光标记技术研究VP1蛋白与RdRp蛋白在Sf9细胞的表达,观察发现VPl蛋白在Sf9细胞的表达呈囊泡状;而RdRp蛋白在Sf9细胞的表达呈点状颗粒。VP1蛋白与RdRp蛋白同时侵染Sf9细胞,能完全共定位,说明二者之间存在相互作用的关系。酵母双杂交技术进一步验证了 VP1蛋白与RdRp蛋白存在特异性的互作。这些结果说明CSBV结构蛋白VP1和非结构蛋白RdRp之间存在相互作用。本研究利用中华蜜蜂胚胎原代细胞体系研究VP1蛋白与RdRp蛋白在细胞内的表达及CSBV在细胞水平上的复制。首先建立中华蜜蜂胚胎原代细胞的培养。用牙签挑取36-48 h的卵,经70%酒精消毒、胰酶消化,转入细胞培养瓶中,28℃培养箱中培养。培养12 h后,细胞开始贴壁生长,贴壁的单个细胞直径在8-10μm。细胞培养3-4 d后可用于病毒侵染实验。CSBV侵染后36 h,用免疫荧光标记技术研究VPl蛋白与RdRp蛋白在细胞内的表达。VP1蛋白在培养细胞内的表达呈纤维丝状或囊泡状;而RdRp蛋白在培养细胞内的表达呈点状颗粒。用VP1蛋白与RdRp蛋白的荧光抗体同时标记CSBV侵染后的细胞,发现VP1与RdRp能共定位,且VP1蛋白包裹着RdRp蛋白。常温电镜观察CSBV病毒粒体在细胞内的分布,发现大量的CSBV病毒粒体聚集在有囊膜的囊泡内或呈念珠状排列。为研究CSBV在培养细胞内的增殖情况,利用RT-qPCR技术测定不同侵染时间CSBV相关基因的表达量,结果显示,CSBV侵染细胞后12-48 h,CSBV基因的表达量急剧上升,CSBV在大量的复制;48 h后,CSBV基因的表达量急剧下降。本研究利用RNA干扰技术来抑制CSBV的复制。首先建立实验室条件下饲养中华蜜蜂幼虫和CSBV接种的方法;用T7 RiboMAXTM Express RNAi System Kit 体外合成 CSBV 同源的特异 dsRNA(dsHelicase、dsProtease、dsRdRp 和dsVPl)。将dsRNA和CSBV通过添加到饲料中喂给幼虫,以dsGFP作为对照。先给2日龄幼虫饲喂dsRNA,12 h后再接种病毒,发现饲喂dsRdRp后,幼虫的化蛹率显著上升。同时用RT-qPCR检测RNA干扰后CSBV基因表达量的变化,结果表明饲喂dsRdRp后,幼虫体内CSBV基因的表达量显著降低,说明dsRdRp能有效抑制CSBV的增殖。为了将dsRdRp应用到生产实践中,将RdRp基因连接到L4440载体中,转化至大肠杆菌HT115菌株中表达dsRdRp。将含有dsRdRp的大肠杆菌饲喂给自然患病的蜂群,研究其对中华蜜蜂囊状幼虫病的防治效果。结果显示,相对于饲喂dsRdRp前,3周后,中浓度和高浓度2个处理组蜂群内病虫数量显著减少;封盖子数量显著增加;群势显著增长。同时,后代的带毒率明显下降;CSBV基因的表达量也显著下降,说明CSBV同源的特异dsRdRp能有效抑制病毒的复制,达到治疗病毒的效果。