草鱼养殖作为我国养殖产量最高的渔业产业为满足人类的蛋白食品需求提供了重要保障,但是长期以来的高密度养殖方式造成了草鱼出血病的频繁暴发并引起巨大的经济损失。目前草鱼出血病的疫苗防治研究虽取得了较大进展,但草鱼呼肠孤病毒(Grass carp reovirus,GCRV)频繁变异和疫苗商业化大规模应用瓶颈制约了病害防治研究应用进程,采用药物进行防治目前尚为大规模防治草鱼出血病的最为直接有效的途径。因此,抗病毒药物开发以及相关机制研究在草鱼出血病防治领域显得尤为重要。盐酸吗啉胍(Moroxydine hydrochloride,Mor)作为双胍结构药物因缺乏确切的药理学和毒理学研究证据在1999年被国家宣布停用,该药物一直以来未受重视。本研究前期发现Mor具有良好的抗GCRV活性,因此在对其进行安全性进行检测前提下,进一步对Mor的抗病毒和抗细胞凋亡等机制进行研究。取得结果如下:1.Mor体外抗GCRV活性研究通过借助体外抗病毒药物筛选模型,发现Mor对四株水产病毒感染下的体外培养细胞起到了不同程度的保护作用,尤其是在100μg mL-1的初筛试验中实现了对感染两株GCRV病毒的草鱼肾细胞(CIK)100%的保护;通过体外毒性试验得出Mor对CIK和GCO细胞的安全浓度分别是218.5±9.5μg mL-1和140.9±25.7μg mL-1。此外,高效液相色谱检测药物含量发现在4 h内Mor在每106个细胞中的含量迅速达到最高水平的16.7±0.6μg,表现出良好的代谢特性。选取高毒力的GCRV104为试验材料,通过进一步在CIK和草鱼卵巢细胞(GCO)中进行药物抗病毒梯度试验,结果发现Mor在39.8μg mL-1的浓度处理下能保证超过90%的细胞活力,并阻止了细胞病变效应的产生,其效果好于相同浓度的三氮唑核苷(Rib)对照组;通过进一步的试验得出在20μg mL-1的Mor处理72 h后能够使CIK和GCO细胞内病毒的滴定度分别降低7.7和5.7个自然指数级;同时抑制了各病毒基因在两种细胞内的表达,并呈现出一定的时间依赖效应;进一步的Western-blot检测结果验证了Mor的抗GCRV活性,表现出了较高的体外抗GCRV活性和对宿主细胞的安全性。2.Mor在体抗GCRV研究首先通过药物对草鱼的急性毒性试验发现,当Mor在1000μg mL-1浓度范围内对草鱼无毒性,表现出对草鱼良好的安全性。再以草鱼仔鱼的人工注射感染GCRV为基础,通过Mor的浸泡和注射处理对草鱼体内抗病毒作用进行研究,结果表明:GCRV病毒在感染后在组织内繁殖和并对草鱼造成机体氧化损伤,并在7 d后达到56.7%的死亡;而经Mor注射处理7 d后在肾脏、肝脏、鳃和肌肉中的病毒VP3和VP6的相对表达值均低于0.07,其抗病毒效果明显好于药物浸泡处理组;同时避免了血清超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)和总抗氧化能力(T-AOC)活性的下降,在药物治疗的7d内无非正常死亡现象的发生。3.Mor抑制GCRV蛋白表达利用真核载体构建将GCRV VP6成功连入pIRES2-AcGFP1真核表达质粒中,并转染进入CIK细胞中进行蛋白表达,借助细胞活力检测和流式细胞检测发现重组质粒pIRES2-AcGFP1-VP6转染细胞48 h内不会引起明显的凋亡效应,细胞保持正常的活力;荧光显像技术检测发现质粒转染细胞48 h后显著表达,在经Mor处理后细胞内蛋白表达受到明显抑制,荧光表达强度显著降低,仅在细胞内局部位置显现;经实时荧光定量PCR测定表明,pIRES2-AcGFP1-VP6转染CIK细胞后72 h内VP6的表达逐步上调,相对病毒感染对照组其相对表达值达到0.59,但经20μg mL-1的Mor处理后VP6在细胞内的表达显著下调,相对表达值降至0.14,体现出药物对该病毒蛋白良好的抑制作用。4.Mor抗CIK细胞凋亡机制研究通过荧光显像、扫描透射电镜观察和DNA电泳等多种方式对细胞凋亡进行研究,发现GCRV感染48 h内宿主细胞产生一系列的细胞凋亡特征,包括细胞核质的融解消失、DNA片段化、细胞形态皱缩断裂、细胞内GCRV病毒粒子增殖复制、细胞包涵体空洞产生以及细胞破裂释放病毒等多种变化,进而导致严重的细胞凋亡。而凋亡抑制剂试验结果初步表明GCRV感染后CIK细胞经Caspase途径导致细胞凋亡,进一步利用Western-blot试验发现病毒感染导致了caspase-9和下游caspase-3的激活,其上游Bax促凋亡蛋白和Bcl-2凋亡抑制蛋白的表达也分别出现了相应的上调和下调,表明GCRV病毒感染后激活了细胞线粒体凋亡通路,进而导致凋亡的发生。在对细胞凋亡检测的同时,通过Mor处理后的细胞有效阻止了各凋亡现象的发生,并有效阻止了线粒体凋亡通路的启动,实现对细胞的保护作用。5.Mor对宿主免疫反应的影响通过对宿主免疫相关基因的检测,发现GCRV感染后会迅速引起宿主细胞内免疫相关基因Myd88、Mx1、IL-1β、IL-8、I-IFN和TNFα表达的普遍上调,而在药物处理下显著降低了病毒诱导的细胞免疫反应;进一步地对人工染毒草鱼组织的免疫相关基因进行检测,发现注射GCRV之后草鱼机体出现明显的免疫刺激反应,同样地,当Mor药物注射治疗能够显著抑制各组织内免疫相关基因IFN-I、IL-1β和TNF-α的上调。综上所述:Mor能够通过直接的抗病毒作用抑制GCRV病毒的增殖,同时阻止细胞凋亡信号的启动,对宿主保持正常的生理状态具有重要意义,实现了良好的体内外抗病毒效果,在草鱼出血病药物防治中具有较大的应用前景。