长牡蛎(英文名:Pacific oyster,拉丁文名:Crassostrea gigas)又称为太平洋牡蛎,属于软体动物门、双壳纲、牡蛎目、牡蛎科、牡蛎属。牡蛎肉鲜味美,营养价值极高,可以加工成单冻半壳牡蛎、牡蛎提取液、牡蛎保健品、蚝油等,是一类十分重要的海洋食品。长牡蛎最大的特点是左壳可以很牢固的附着到其它物体表面,而右壳却不能。我们推断左壳中应该具有一些右壳中不存在的特殊物质来执行附着功能。牡蛎的壳是由外套膜生物矿化形成的,左外套膜形成左壳,右外套膜形成右壳。左右壳功能的不同也就意味着左右外套膜分子的差异。我们从左右外套膜分子差异入手,试找出左壳的附着机制,为以后进一步分析研究执行附着机制的特殊物质,提供理论基础。而且牡蛎生活的早期有个浮游的过程,幼虫随海流寻找适合固着的场所,这种附着是在水下完成的,也就意味着特殊粘性物质在水中也可以发挥作用。为以后提高牡蛎壳的附加值提供一条途径,同时,本研究的结果还为左右对称动物的对称器官功能分化研究提供一些线索,也为如何提高牡蛎幼虫的附着率提供了重要参考。目前,关于左、右外套之间功能差异的分子机制尚不清晰。本研究分析比较了长牡蛎左右外套膜间的差异蛋白、差异表达基因、甲基化差异基因,通过取交集,筛选出了与长牡蛎附着有关的基因,通过分析,认为长牡蛎左壳附着可能与TGF-β信号通路有密切关系;通过研究两种钾离子通道抑制剂:TEA(电压门控钾离子通道抑制剂)和格列本脲(内向整流性钾离子通道抑制剂)对牡蛎幼虫附着的影响,发现电压门控钾离子通道在长牡蛎幼虫附着中可能起着更重要的作用;另外,我们克隆了在长牡蛎左右外套膜中表达量有差异的钙调素蛋白基因(cgCaM),分析了其组织表达特征、进化特征和功能意义。具体结果如下:1.完成了对长牡蛎附着斑蛋白、左右壳蛋白的提取与测定,并分析了左右壳的蛋白差异表达情况。分别分离并提取左、右壳的总蛋白质(包括可溶性和不可溶性基质蛋白)。根据已完成的长牡蛎的壳蛋白组,通过比较分析确定了左右壳以及附着斑的蛋白组。通过与已知的248个牡蛎蛋白比对,在左右壳内,分别找到26个及22个蛋白质。比较分析左、右壳间的蛋白表达情况,共发现3个差异表达蛋白。由于是利用已发现的牡蛎壳蛋白的数据寻找的左、右壳差异表达蛋白,因此,仅在248个蛋白内,进行肽段的比对,在左、右壳的蛋白数据中共发现6个共同变化蛋白质。相比于右壳,在长牡蛎的左壳中有3个蛋白(EGF,Hsp70,SOD)出现了差异变化。2.通过RNA-seq技术比较分析了长牡蛎左右外套膜的mRNA表达情况,共有18457个基因具有GO注释信息,左右外套膜组织内基因多集中在细胞内过程,代谢过程,生物调节,应激反应等生物学过程中。通过对左右外套膜基因FPKM值的比较,分析差异表达基因分布情况,显示长牡蛎左右外套膜中表达的相关胞外蛋白存在一定的差异,左右外套膜在指导相关分子的跨膜转运、细胞粘附及转录过程中存在一定的差异,从而可能是导致两侧壳的外形及功能出现差异的原因之一。分析差异表达的基因,其中,在左外套膜中有5个过氧化酶较右外套膜中的表达量出现了显著下调。在左外套膜中的低表达POD(过氧化物酶)可能说明在非特异性免疫防御的氧化应激方面,长牡蛎的右壳要起到更大的作用。KCP及Temptin在左右外套膜中的差异表达,也许说明其可能是调控长牡蛎左壳及右壳具有不同外形及功能的关键分子。3.通过MethylRAD技术比较分析了长牡蛎左右外套膜的基因组DNA甲基化差异,在CCGG位点共找到2286个差异基因,在CCWGG位点共找到2522个差异基因。相关基因的甲基化差异可能表明长牡蛎左右外套膜中神经信号传递,转录,RNA及蛋白质的调节等方面存在显著的差异,其中TGF-β信号通路关键基因(PITX2和BMP4)的甲基化水平存在明显差异,说明牡蛎的左右外套膜可能存在发育的差异,并导致两侧的功能及功能差异产生。整合RNA-seq及甲基化分析结果,发现多种TGF-β(transforming growth factor-β,TGF-β)信号通路相关基因的差异表达,可能说明虽然长牡蛎是双贝类,但是在长期的自然选择下,左右外套膜发生了左右不对称发育,并进化出了不同的功能,特别是左壳能够附着的功能。通过荧光定量分析,相比于右外套膜,在长牡蛎左外套膜中CMP和COL的上调表达可能说明在左右外套膜间的差异结构组建。而PITX2和KCP在左外套膜中的下调表达暗示长牡蛎中的左右不对称发育调节差异,可能是导致长牡蛎左壳与右壳具有不同外形及功能的原因。4.在长牡蛎左右外套膜转录组的差异基因集中发现了两种钾离子通道蛋白,为了确定哪种钾离子通道对于牡蛎附着变态具有更重要的意义。我们完成了钾离子浓度对长牡蛎附着与变态作用率的影响研究,通过不同的钾离子暴露试验,显示牡蛎幼虫的相对变态率会随着钾离子浓度的增加而降低。利用两种钾离子通道抑制剂TEA(电压门控钾离子通道抑制剂)和格列本脲(内向整流性钾离子通道抑制剂)研究钾离子通道对牡蛎幼虫附着的影响,我们发现TEA对幼虫的附着的抑制作用更明显,表明电压门控钾离子通道在长牡蛎幼虫附着中可能起着更重要的作用。5.在长牡蛎左右外套膜转录组的差异基因中集中发现了钙调控蛋白基因,了解长牡蛎钙调蛋白基因的序列和功能特征,将帮助我们理解软体动物壳形成的分子机制。为了获得长牡蛎钙调蛋白的具体信息,我们克隆了长牡蛎钙调蛋白基因(cgCaM)的全长cDNA序列,发现其ORF编码113个氨基酸,含有3个EF-hand钙结合结构域,其mRNA表达水平在外套膜中最高,这表明cgCaM基因可能在长牡蛎的壳形成过程中起重要作用,进化分析表明腹足纲和双壳纲的共同祖先可能拥有至少3个CaM基因。我们还发现,钙化程度高的物种中含有更多的EF-hand钙结合结构域,而在参加比较的几种软体动物中,长牡蛎具有最厚重的贝壳,长牡蛎基因组中也含有最多数量的EF-hand钙结合结构域,这进一步提示了 CaM和生物矿化之间的联系。