恶性肿瘤被认为是当前危害人类健康的最重大疾病之一。尤其是恶性肿瘤的愈后复发、转移,已经成为提高抗肿瘤疗效和提升患者存活率的最大障碍。据统计,90%以上的癌症患者死亡原因与肿瘤转移及其并发症相关,肿瘤转移无疑成为肿瘤研究的重要方向。分离迁移能力有差异的肿瘤细胞,则可以进一步分析不同迁移能力细胞的基因特征,这对于肿瘤侵袭和癌症的治疗研究具有重要意义。纸是人类最古老的重要发明之一。近年,利用液体在纸纤维基底内的浸润扩散作用,发展了纸基微流分析系统（Microfluidic paper-based analytical devices,μPADs）,并进一步将细胞先混合于水凝胶溶胶中再滴加到滤纸上,建立了“cells-in-gels-in-paper,CiGiP”细胞培养模式。纸质基底中存在大量类似组织间隙的微小孔隙,允许物质穿透并为细胞提供养分。更为重要的是通过多层叠加可以快速实现3D结构的构建,而拆分多层纸基叠加可以将3D转化为2D结构,便于区分观察细胞和进一步分析细胞功能。基于对以上研究领域的现状分析,本论文中利用擦镜纸和热敏柔性封口膜(Parafilm？)通过热塑封法构建了纸基三维细胞培养芯片;通过多层CiGiP纸基芯片叠加构建细胞迁移平台,用于研究肿瘤细胞在不同层纸基间的迁移;在此基础上利用多层CiGiP芯片可叠加-拆分的特点,量化细胞运动并分选出具有不同运动能力的细胞,进一步分析了不同迁移能力细胞的基因特征;最后构建了集成式逆转录-环节导等温扩增（Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP）快速检测装置对多层CiGiP分选的肿瘤细胞进行肿瘤标志物的检测,验证多层CiGiP细胞迁移平台的细胞分选性能。本论文的主要研究内容如下:1.建立基于擦镜纸-热敏柔性封口膜(Parafilm？)的CiGiP细胞培养芯片加工新方法纸是一种新型的细胞培养材料,在细胞三维培养领域展现了极大的潜力。为了开发简便、低成本的纸基三维细胞培养方案,本研究比较了Whatman？1#滤纸、打印纸和Whatman（？）？105#擦镜纸的物理和化学性质。结果发现,相比于Whatman（？）？1#滤纸和打印纸,Whatman（？）？105#擦镜纸具有更好的柔韧性、稳定性和通透性,是一种较为理想的支架材料。建立了基于擦镜纸和热敏柔性封口膜(Parafilm？)的构建纸基细胞芯片的新方法。首先在Parafilm？膜上切割出用于细胞培养的区域,然后通过热塑封法将擦镜纸-Parafilm？-擦镜纸三明治结构压制成具有独立亲疏水区域的纸基芯片,用于构建CiGiP纸基三维细胞培养芯片。通过对比不同的凝胶浓度与纸基芯片的结合效果,对凝胶浓度进行优化。通过检测CiGiP纸基细胞培养芯片中细胞的增殖率,发现CiGiP纸基芯片中的细胞生长状态良好,细胞在纸基芯片中趋向于聚集生长。与其它构建纸基细胞芯片的方法相比,本实验所设计的方案具有低成本、制作简单的优势。2.构建多层CiGiP芯片分选具有不同侵袭力的肿瘤细胞并研究其基因特征癌细胞转移被认为是恶性肿瘤进展的一个标志,因此,测量癌细胞的运动,探究肿瘤细胞迁移能力与细胞侵袭之间的关系,将有助于进一步了解肿瘤转移机制。为了研究不同迁移性能细胞所具有的基因特征,本研究构建了多层CiGiP三维细胞芯片作为肿瘤细胞迁移平台。首先对多层CiGiP三维细胞芯片的叠加层数和前列腺癌细胞DU145迁移培养时间进行了优化。通过拆解多层纸基芯片,对各层中的细胞进行检测,结果发现只有一小部分细胞能成功从细胞接种层侵袭至多层结构的顶层和底层。在相同时间内迁移的层数越多,说明这部分细胞具有更强的侵袭性能。进一步通过荧光定量PCR对迁移至各层的细胞进行检测,结果显示具有较高侵袭潜能的细胞,其癌症干细胞（cancer stem cell,CSC）生物标志物ALDH1A1、SOX2、NANOG和OCT4的表达均有显著增加。最后,收集迁移至不同层的肿瘤细胞进行化疗药物敏感性检测,结果表明通过多层CiGiP芯片分选出的具有高侵袭的肿瘤细胞对阿霉素耐受性更强。本工作首次通过多层CiGiP三维细胞芯片实现对具有不同侵袭能力的肿瘤细胞的分选,并进一步探讨了具有高侵袭力的肿瘤细胞的基因特点,提示了肿瘤侵袭能力与癌症干细胞之间的相关性。3.构建纸基RT-LAMP芯片对CiGiP三维细胞芯片分选出的癌症细胞进行快速检测为了对CiGiP三维细胞芯片分选出的癌症细胞进行快速检测,本工作构建了纸基RT-LAMP芯片对前列腺癌细胞特异性生物标志物（prostate cancer antigen 3,PCA3）进行检测。LAMP是一种新型核酸等温扩增方法,在生物检测领域有着较大的应用前景。该检测装置主要结构包括纸基RT-LAMP芯片、温控模块和成像模块。RT-LAMP芯片由加载RT-LAMP试剂的核酸扩增区和负载了钙黄绿素和氯化锰的滤纸的比色检测区两部分构成,并通过3D打印构建的通道连接。该分离式设计避免了显色染料对核酸扩增效率的影响。温控模块可通过电池供电,提高了便携检测的可能性。挤压扩增区的海绵垫,可以将核酸扩增产物挤入比色检测区进行显色反应。通过对芯片上RT-LAMP的反应时间和温度进行优化,提高了检测灵敏度。成功对多层CiGiP芯片分离的不同侵袭力肿瘤细胞进行了特异性标志物PCA3的检测,进一步展示了多层CiGiP细胞迁移平台对癌细胞的分离和筛选能力。