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辽东楤木叶系五加科楤木属辽东楤木（Aralia elalta（Miq.）Seem.）的干燥叶,具有清热利湿,益气补肾功效。目前,以辽东楤木叶总皂苷提取物为原料的龙牙楤木叶胶囊已是黑龙江中医药大学二附院院内制剂,其临床上主要用于癌症患者的辅助治疗。本课题组前期研究发现,辽东楤木叶中的三萜皂苷类成分为其抗肿瘤作用的主要药效物质基础。为了进一步阐明辽东楤木叶抗肿瘤有效部位（总皂苷提取物）的作用机理及其体内药代动力学特征,本研究通过液相色谱质谱联用（LC-MS）技术,以整体动物研究给予辽东楤木叶总皂苷提取物后其主要的6种三萜皂苷成分的药代动力学特性,并对其潜在的代谢性药物相互作用风险进行了初步的评价,同时运用代谢组学的方法研究了药物作用3种癌细胞后其代谢物的差异,通过对差异物的生物学意义分析和验证,初步阐明了辽东楤木叶抗肿瘤有效部位的作用机制。本论文的研究内容主要包括以下五个部分:1.辽东楤木叶及其抗肿瘤有效部位的含量测定研究本文采用HPLC-ELSD法同时测定辽东楤木叶及其抗肿瘤有效部位中4种三萜皂苷的含量。色谱柱为Diamonsil C18（4.6mm×250 mm,5μm）;流动相:乙腈-水溶液,梯度洗脱;流速为0.8mL/min;检测器为蒸发光散射检测器,载气流速为3.0 L/min,漂移管温度为110℃。4种三萜皂苷成分在相应的线性范围内均具有良好的线性。运用该含量测定方法共测定了 11个产地共53批次样品中4种皂苷的含量,结果显示5月份样品中三萜皂苷的含量均较低,7月和8月份含量较高,而6月和9月份不同时间段的样品之间差异明显,其中6月下旬和9月上旬的样品中三萜皂苷含量相对偏高。因此,从4种三萜皂苷的含量结果来看,辽东楤木叶的最佳采收期为7月和8月,但不同区域可能要结合地区的气候环境适当的提前或延后。本文所建立的方法高效、灵敏、稳定可靠,为辽东楤木叶及抗肿瘤有效部位的质量评价提供的方法。2.辽东楤木叶抗肿瘤有效部位的药代动力学研究本文建立了同时测定大鼠血浆中6种辽东楤木叶皂苷的LC-MS/MS方法,并采用蛋白沉淀法进行血浆样品的前处理,色谱柱采用 ACQUITY UPLC HSS T3（100mm×2.1mm,1.7μm）;流动相:水（含0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）,梯度洗脱;流速0.3mL/min;采用负离子检测方式,MRM检测模式。运用该方法测定给药后不同时间点血浆中6种三萜皂苷的浓度,绘制了血药浓度-时间曲线,并计算了主要的药物动力学参数。结果表明,6种辽东楤木叶皂苷在大鼠体内吸收较快,消除也较快,不易产生体内蓄积。此外,由于6种分析物的化学结构相似,其血药浓度-时间曲线的趋势表现出一致性,表明它们具有相似的口服吸收和消除。3.辽东楤木叶抗肿瘤有效部位及其皂苷成分对CYP450酶的影响本文建立了同时测定6种探针底物代谢产物的LC-MS/MS方法。色谱柱采用ACQUITY UPLC HSS T3（100mm×2.1mm,1.7μm）;流动相:水（含 0.1%甲酸）-乙腈（含0.1%甲酸）,梯度洗脱;流速0.3mL/min;采用正负离子结合的检测方式,MRM检测模式。运用该方法评价了辽东楤木叶抗肿瘤有效部位及其三萜皂苷成分对人肝微粒体酶的影响。结果显示,辽东楤木叶6种皂苷均表现出对P450酶的抑制作用,其中最小的IC50值为0.981μg/mL。而辽东楤木叶抗肿瘤有效部位的抑制作用相比较弱,只对CYP2A6和CYP2B6有一定抑制作用,其IC50值分别为159.7 μg/mL和69.36 μg/mL。4.基于细胞代谢组学研究辽东楤木叶抗肿瘤有效部位抑制3种癌细胞的作用机制本文以LC-MS/MS联用技术为平台,通过多元统计分析等手段探索了辽东楤木叶抗肿瘤有效部位作用3种癌细胞后其细胞内代谢物的变化,同时利用Progenesis QI 2.0软件对具有显著性差异的物质进行快速分析和鉴定,其中,HepG-2细胞中共鉴定出蛋氨酸、8,11,14二十碳三烯酸、9（10）-环氧十八碳二烯酸和十六碳烯酸等20中代谢差异物;MCF-7细胞中共鉴定出2（R）-羟基二十二烷酸、9-羟基二十二烷酸和7,10,13,16-二十二碳四烯酸等9种代谢差异物;BGC-823细胞中共鉴定出15（S）-羟基二十碳三烯酸.、二十二碳三烯酸和3（R）-羟基十四烷酸等9种代谢差异物。通过对差异代谢物的生物学意义分析,推测出辽东楤木叶抗肿瘤有效部位可能通过对3种癌细胞线粒体功能的影响而抑制其生长和增殖。5.辽东楤木叶抗肿瘤有效部位对3种癌细胞能量代谢的影响本文采用海马生物能量测定仪来检测3种癌细胞空白组与给药组的氧消耗率水平。结果显示:与空白组相比,给药组癌细胞的线粒体氧化磷酸化和非线粒体产生的能量均有显著下降（P<0.01）,且给药剂量越大这种趋势越明显,同时辽东楤木叶抗肿瘤有效部位还能够有效降低BGC-823细胞和MCF-7细胞的ATP产量和线粒体储备能量（P<0.01）。本文还分别考察了辽东楤木叶抗肿瘤有效部位对3种癌细胞ATP水平、活性氧（ROS）水平、线粒体呼吸链酶复合物Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ活性以及线粒体膜电位水平的影响。结果显示:辽东楤木叶抗肿瘤有效部位能够显著的降低3种癌细胞的ATP水平,且给药剂量越大下降越明显;除低剂量组对HepG-2细胞ROS水平影响无统计学意义外,其他组均能显著提高ROS水平;与空白对照组相比,各给药组呼吸链酶复合体活性均有所下降,并具有显著性差异,其中复合物Ⅰ、Ⅲ和Ⅳ的活性下降幅度较为明显,各给药组虽然能够降低复合物Ⅱ活性,但与前3种复合物相比,其下降趋势不如前3种明显;各给药组的线粒体膜电位下降趋势明显,且与空白对照组相比均具有显著性差异。以上实验结果初步表明辽东楤木叶抗肿瘤有效部位对癌细胞能量代谢的影响可能与其诱导ROS累积有关。综上所述,本文建立了辽东楤木叶药材及其抗肿瘤有效部位的含量测定方法,并对辽东楤木叶抗肿瘤有效部位的药代动力学进行了较为系统研究,初步阐明了辽东楤木叶抗肿瘤有效部位在大鼠体内的药物代谢动力学特征及其对CYP450酶活性的影响,为辽东楤木叶抗肿瘤有效部位临床前的安全性和有效性评价提供药代动力学依据。通过细胞代谢组学研究发现了辽东楤木叶抗肿瘤作用的机制,并采用海马生物能量测定仪等分析手段对发现的作用机制进行了初步的验证,为辽东楤木叶抗肿瘤作用机制的深入研究奠定了基础。