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颅脑创伤(TBI)是威胁人类健康的主要疾病之一,目前仍无特效的治疗措施。颅脑创伤的病理过程分为原发伤和继发伤,原发性损伤发生在损伤即刻,无法进行干预,而继发性损伤发生在损伤之后数分钟至数周,由多种细胞因子和炎症因子介导,可以进行干预。越来越多的研究表明小胶质细胞介导的炎症反应在继发性颅脑损伤中起着重要作用。目前文献将激活的小胶质细胞分为两种亚型:M1型,具有促炎作用,M2型,具有抑炎作用。通过抑制小胶质细胞向M1型极化,促进其向M2型极化已经在多种中枢神经系统疾病动物模型中显示出神经保护作用。然而,抑制小胶质细胞向M1极化,促使其向M2型极化对颅脑创伤的作用及机制仍无相关报道。在本研究中我们结合体内、外实验研究调控小胶质细胞向M2亚型极化对神经炎症反应、轴索损伤以及颅脑创伤神经功能预后的影响,为开发颅脑创伤治疗的潜在新方法提供新思路。本研究分为三个部分:第一部分:小鼠原代小胶质细胞的分离、培养和鉴定;第二部分:体外实验研究PPAR-γ激动剂调控小胶质细胞向M2型极化对LPS刺激后神经炎症反应的影响;第三部分:动物实验研究研究PPAR-γ激动剂调控小胶质细胞向M2型极化对颅脑创伤预后的影响。第一部分 小鼠原代小胶质细胞的分离、培养和鉴定目的:利用新生小鼠分离、培养小鼠原代小胶质细胞,评估原代小胶质细胞的纯度,为进一步开展体外实验研究调控小胶质细胞极化亚型对炎症反应的影响奠定基础。方法:利用新生的C57BL/6小鼠(1-2d),无菌条件下断头、取脑,显微镜下分离大脑皮层。切碎、消化、离心、重悬,将细胞接种于多聚赖氨酸包被的培养瓶中,原代混合胶质细胞培养至第9天,细胞出现明显分层生长,待细胞完全分层2天后进行摇床震摇分离,然后利用Iba-1免疫荧光检测。结果:在倒置相差显微镜下可观察到混和胶质细胞长满瓶底,并出现明显的细胞分层现象,底层为扁平、多种形状的、具有多个突起的星型胶质细胞,上层细胞呈偏小、类圆形、折光性强,附着于星型胶质细胞表面生长,为小胶质细胞。静息状态的小胶质细胞表现为胞体较小,具有分支状突起,而激活状态的小胶质呈现圆形或椭圆形。Iba-1免疫荧光鉴定小胶质细胞纯度92.58%。结论:原代分离、培养的小胶质细胞纯度较高,可用于进一步开展体外实验研究小胶质细胞极化亚型调控对神经炎症反应的影响。第二部分 体外实验研究PPAR-γ受体介导小胶质细胞向M2亚型极化对神经炎症反应的影响目的:通过体外实验研究调控小胶质细胞向M2型极化对LPS刺激后小胶质细胞介导的神经炎症反应的影响。方法:构建小胶质细胞培养体系,并将其分为以下实验组:小胶质细胞组,小胶质细胞+LPS组,小胶质细胞+LPS+罗格列酮(PPAR-丫激动剂)组,小胶质细胞+LPS+GW9662(PPAR-y拮抗剂)组。利用 ELISA 检测炎症因子 TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平,PCR检测小胶质细胞极化标志物M1型(CD16/32,CD86),M2型(CD206,Ym-1)表达水平以鉴定小胶质极化亚型改变。结果:相比于对照小胶质细胞,LPS刺激后小胶质细胞M1亚型标志物表达水平升高,M2亚型标志物表达下降,炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达显著升高。相比于LPS刺激组,罗格列酮处理组小胶质细胞M1型标志物表达水平降低,M2型标志物表达升高,同时炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平显著降低,GW9662处理组小胶质细胞M1型标志物表达升高,M2型标志物表达下降,同时炎症因子表达水平升高。结论:LPS处理后小胶质细胞向M1亚型极化增强,伴随炎症因子表达上调,利用罗格列酮调控小胶质细胞向M2型极化可以降低LPS刺激后小胶质细胞炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达,减轻炎症反应。第三部分 动物实验研究PPAR-γ受体介导小胶质细胞向M2亚型极化对颅脑创伤预后的影响目的:通过动物实验研究调控小胶质细胞向M2亚型极化对颅脑创伤后神经炎症反应、轴索损伤以及神经功能预后的影响。方法:利用C57BL/6小鼠构建液压损伤的颅脑创伤模型,并将小鼠分为以下实验组:假手术组,颅脑创伤组,颅脑创伤+罗格列酮(PPAR-γ激动剂),颅脑创伤+GW9662组(PPAR-γ拮抗剂)。利用NSS评分评估小鼠TBI后的神经功能预后,ELISA检测小鼠脑皮层中炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平,镀银染色以及β-APP免疫组化检测小鼠皮层中轴索损伤情况,qRT-PCR检测小胶质细胞极化标志物M1型(CD16/32,CD86),M2型(CD206,Ym-1)表达水平,免疫荧光检测小胶质细胞极化表型。结果:相比假手术组小鼠,颅脑创伤后小鼠脑组织中小胶质细胞M1亚型标志物表达水平升高,M2亚型标志物表达下降,炎症因子TNF-αα、IL-1β、IL-6和IL-10表达显著升高,轴索损伤指标β-APP显著升高。相比于TBI组小鼠,罗格列酮处理组的小鼠小胶质细胞M1型标志物表达水平降低,M2型标志物表达升高,同时炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6和IL-10表达水平显著降低,轴索损伤指标β-APP显著降低,NSS评分降低。相比于TBI组小鼠,GW9662处理组小鼠小胶质细胞M1型标志物表达水平升高,M2型标志物表达降低,同时炎症因子表达水平上升,轴索损伤指标β-APP也显著升高,NSS评分升高。结论:颅脑创伤后小胶质细胞向M1型极化增强,伴有炎症因子表达上调。利用罗格列酮(PPAR-γ激动剂)调控小胶质细胞向M2型极化可以减轻颅脑创伤后脑皮层中炎症反应,减轻轴索损伤情况,改善神经功能预后。