双峰驼IgG亚型分离纯化及其多克隆抗体制备

来源 :甘肃农业大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:asdf20091234567889
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双峰驼在干旱和荒漠环境中形成了其独特的器官构造和独特的适应环境能力。在双峰驼血清中IgG的三个亚型中,IgG1是由两条同源的轻链和两条同源的重链构成的四聚体,而IgG2和IgG3是由两条同源的重链构成的二聚体,因天然缺少轻链被称作重链抗体。重链抗体占双峰驼循环抗体的75%,因其独特的结构和许多特有的生物学功能,在双峰驼体液免疫中发挥重要作用。本研究应用Protein A和Protein G亲和层析柱分离纯化双峰驼血清,得到双峰驼IgG的三个亚型(IgG1、IgG2和IgG3),通过不同条件下的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定双峰驼IgG三个亚型是否符合其分子量和结构;以IgG1、IgG2和IgG3为抗原分别免疫健康成年雄兔制备多克隆抗体,应用ELISA对制备的多克隆抗体进行抗体效价测定,并对其多克隆抗体之间的特异性做初步判断;应用Western blotting评估其三个亚型多克隆抗体在双峰驼血清中的特异性及其多克隆抗体之间的特异性;通过免疫组织化学方法对双峰驼脾脏中分泌IgG的浆细胞进行初步研究。在不同条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳的结果中双峰驼IgG三个亚型符合其分子量和结构并且结果中显示无其它蛋白符合做多克隆抗体的条件。在ELISA结果中显示抗体效价符合实验目的而且初步判断这三个亚型的多克隆抗体具有交叉反应。在Western blotting结果中显示三个亚型的多克隆抗体具有交叉反应。在免疫组织化学结果中对双峰驼脾脏中阳性细胞分布情况进行光镜观察及数据统计分析,发现分泌脾脏中阳性细胞在边缘区和红髓高于白髓。分别使用IgG三个亚型多克隆抗体的免疫组化结果进行数据统计分析,红髓中阳性细胞密度差异不显著(P>0.05);白髓中使用IgG1多克隆抗体的阳性细胞密度与使用IgG2多克隆抗体的阳性细胞密度相比极显著增多(P<0.01);使用IgG1多克隆抗体的阳性细胞密度与使用IgG2和IgG3多克隆抗体的阳性细胞密度相比显著增多(P<0.05),使用IgG2多克隆抗体的阳性细胞密度与使用IgG3多克隆抗体的阳性细胞密度相比差异不显著(P>0.05)。成功通过Protein A和Protein G亲和层析柱分离纯化出IgG三个亚型(IgG1、IgG2和IgG3)并通过还原和非还原条件下聚丙烯酰胺凝胶电泳证明其三个亚型符合其结构和分子量大小;用双峰驼IgG三个亚型免疫兔子制备双峰驼IgG三个亚型的多克隆抗体,利用ELISA和Western blotting探究其三个亚型多克隆抗体的特异性,发现其三个亚型具有交叉反应;然后对脾脏中阳性细胞进行统计和分析,发现阳性细胞主要分布在边缘区和红髓中。白髓中使用IgG1多克隆抗体阳性细胞密度极显著大于其它两个多克隆抗体的阳性细胞密度。通过本论文为以后双峰驼IgG的相关研究提供基础支持。
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